基因工程疫苗的研究进展

自从 1796年EdwardJenne医生发明第一种真正意义上的疫苗———天花疫苗至今 ,人类已研制出了上千种疫苗并在各种疾病的预防和控制中广泛应用 ,疫苗已成为人类同疾病斗争的一种必不可少的重要武器。传统疫苗的研制和生产主要是通过改变培养条件 ,或在不同寄主动物上传代使致病微生物毒性减弱 ,或通过物理、化学方法将其灭活来完成的。随着人类知识的不断进步 ,传统疫苗的局限性也日益显露出来 :①动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养 ,这使得疫苗生产的成本很高 ;②疫苗中的致病物质在疫苗生产过程中有可能没有完全杀死或充分减毒 ,这会…     

犬细小病毒病基因工程疫苗的研究进展

从犬细小病毒病亚单位疫苗、表位疫苗、核酸疫苗、活载体疫苗等方面,论述了近年来国内外在犬细小病毒病新型疫苗研究方面的新进展,并对各种新型疫苗的优缺点及应用前景进行了讨论,为犬细小病毒病新型疫苗的研制提供理论基础。提出各种犬细小病毒病基因工程疫苗互有优劣,可以通过技术手段采用不同种类的新型疫苗的交叉组合、免疫原的集成使用等研制出更理想、更有效的疫苗。     

杆状病毒表达载体的研究及应用

198 3年Ｓｍｉｔｈ[1] 创建了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (ＡｕｔｏｇｒａｐｈａＣａｌｉｆｏｒｎｉａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ ,ＡｃＮＰＶ )载体表达系统 ,1984年前田进[2 ] 组建了家蚕培养细胞 ,并在幼虫体内成功表达了浕 干扰素 ,其后众多科学家开展了杆状病毒表达载体方面的研究 ,取得了可喜的成绩。目前最常用于表达载体构建的杆状病毒有ＡｃＮＰＶ、家蚕 (Ｂｍｂｙｘｍｏｒｉ,Ｂｍ)核型多角体病毒 (ＢｍＮＰＶ)、粉纹夜蛾 (Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ ,Ｔｎ)核型多角体病毒(ＴｎＮＰＶ)。随着越来越多…     

小鼠抑制素α亚基在杆状病毒表达系统中的表达和纯化

为利用杆状病毒表达系统表达小鼠的抑制素α亚基基因(INHα),将模板质粒pcDNA3.1(+)-INHα中的INHα基因克隆至载体质粒pFastBac1中,构建出重组转座质粒pFastBac1-INHα,转化至感受态DH10Bac细胞,形成重组穿梭质粒Bacmid-INHα,转染至Sf9细胞,获得第一代重组杆状病毒(P1)。然后病毒连续传代2次,用RT-PCR鉴定重组的杆状病毒,用SDS-PAGE验证纯化后蛋白质的表达,并使用BCA蛋白质浓度检测试剂盒检测纯化后的蛋白质样品的质量浓度。结果表明,感染重组杆状病毒后的Sf9细胞能够明显看到细胞皱缩、碎裂等感染症状;RT-PCR能够扩增出1 272bp的条带,证明重组的杆状病毒构建正确;SDS-PAGE结果表明重组的杆状病毒能够表达出45ku的条带,与理论大小一致;利用BCA蛋白质浓度检测试剂盒测得纯化样品中蛋白质的质量浓度为(216.05±10.02)μg/mL。小鼠抑制素α亚基成功地在杆状病毒表达系统中被表达,为今后抑制素的广泛应用奠定了基础。     

昆虫核多角体杆状病毒表达载体在生物医学及兽医学中的应用

核多角体杆状病毒(NPV)是寄生于昆虫类动物的一类DNA病毒。分类上属于杆状病毒科杆状病毒属。属下包括苜蓿银纹夜蛾NPV(AcNPV)和家蚕NPV(BmNPV)等若干种群。特别是AcNPV,它作用目标特异,不感染脊椎动物、不感染益虫、不危害生态环境。因此,作为生物杀虫剂一直很受人们欢迎。随着病毒分子生物学的飞速发展及病毒基因工程技术的普及应用,昆虫NPV分子生物学特性得到进一步阐明。人们发现,AcNPV不但是一种安全可靠的植物杀虫剂,而且也是一种别具特色的表达载体。NPV—昆虫细胞表达系统不但表达效率高,而且表达产物可得正确的修饰和加工。加工后的成熟产物可分泌到细胞     

表达序列标签在寄生虫基因研究中的应用

一个基因组的所有碱基中大约只有 2 %组成编码蛋白质的那部分基因 ,因此 ,测序基因组已不再是一种创建基因目录的有效途径。大量的试验证明 ,以cDNA的形式进行基因转录产物的大规模测序是了解基因组的首选办法。高通量cDNA测序于 1991年由Adams等[1] 创始 ,在构建人脑的cDNA并进行末端单向一次自动测序时首次提出了“表达序列标签 (EST )”概念 ,并发现了 337个基因。EST是对随机挑取的cDNA克隆的外源插入片段的一端或两端进行一次性测序产生的DNA序列 ,长度一般为 30 0～ 5 0 0bp ,一个全长基因转录本的cDNA序列可能包含多个重叠…     

寨卡病毒NS1蛋白在杆状病毒系统中的表达及免疫原性分析

本研究旨在采用杆状病毒表达系统表达并纯化寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)NS1蛋白,并对其免疫原性进行鉴定。将ZIKV NS1基因克隆至杆状病毒载体pFastBac1中,构建重组转移载体,将其转化DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒,经SDSPAGE和Western-blot鉴定蛋白正确表达后,将其感染High5细胞,大量表达重组蛋白,并用镍柱亲和层析法进行纯化,将纯化后的ZIKV NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,进行血清特异性抗体效价检测。最终结果显示,获得了纯度较高分泌表达的ZIKV NS1蛋白,并且血清特异性抗体效价实验表明,纯化的ZIKV NS1蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,有很好的免疫原性。本研究为ZIKV疫苗和诊断试剂盒的研发奠定了重要的基础。     

蓝舌病毒1型VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为了研制蓝舌病新型亚单位疫苗,将蓝舌病毒1型(BTV1)VP2基因克隆到pFastBacHTB载体中,得到重组转座载体pVP2,并转化至DH10Bac感受态细胞,获得了重组杆粒rVP2。然后采用脂质体转染法转染Sf9昆虫细胞,通过克隆筛选获得重组杆状病毒。SDS-PAGE分析结果显示,获得了约110ku的表达产物,与预期结果相符。Western-blot结果显示,目的蛋白能被BTV1感染的山羊阳性血清识别。结果表明,经杆状病毒体系表达的可溶性重组VP2蛋白具有良好的反应原性,为进行蓝舌病新型亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒σB基因在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

本研究旨在通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物学活性的禽呼肠孤病毒σB蛋白。首先,根据NCBI中ARVσB基因序列,设计引物构建σB基因重组供体质粒pFast-σB。随后转化DH10bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-σB。通过脂质体介导法转化sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-σB。将重组病毒感染sf9细胞,表达重组蛋白。通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光(IFA)检测表明,ARVσB蛋白在sf9细胞中成功表达,分子量约为41 ku,并具有良好的生物学活性,为进一步研究ARVσB基因的功能及其基因工程亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

基因工程在寄生虫病研究中的应用

迄今为止,从分子学水平上研究寄生虫病的报道较少。其主要原因是:没有大量能够用于纯化和定性的寄生虫及其抗原不稳定,所以对宿主保护性免疫反应尤为重要的蛋白质的研究与鉴定方面工作就更缓慢了。     

山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达

采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFast-BacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测。结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别。     

双顺反子表达质粒在DNA疫苗研究中的应用

简述了DNA疫苗的研究概况,介绍了真核双表达质粒的结构特点及其在基因佐剂和二价DNA疫苗中的应用情况,总结分析了双表达质粒的优点和存在的问题,并对其今后在DNA疫苗中的研究方向和前景进行了展望。     

仔猪腹泻基因工程双价疫苗的临床应用

仔猪腹泻基因工程双价疫苗的临床应用作者试用仔猪腹泻基因工程双价疫苗对怀孕母猪进行免疫，以控制仔猪腹泻的发生，收到了较好的效果。疫苗来源由上海联盈基因工程有限公司和上海松江兽医生物药品厂联合生产的仔猪腹泻基因工程双价Ｋ８８－Ｋ９９灭活疫苗（以下简称“仔...     

非洲马瘟病毒VP7基因在重组杆状病毒中的表达及抗原性检测

利用pFastBacHTA质粒将非洲马瘟病毒(AHSV)血清4型的VP7基因重组入杆状病毒,并感染昆虫细胞Sf9。结果显示,VP7蛋白在真核细胞内获得了表达,但表达量较低。免疫印迹试验证实,VP7重组蛋白具有较好的免疫原性,将其作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测AHSV的间接酶联免疫吸附试验方法。     

白介素21的研究进展及其在寄生虫学上的应用

白介素21(interleukin-21,IL-21)是近年来报道的一种新的细胞因子,主要由活化的CD4+T细胞、NK细胞和Th17细胞产生,其受体是Ⅰ型细胞因子受体家族成员之一,具有共同的γ链受体。IL-21与其受体结合后可调节B细胞的增殖,促进T细胞、NK细胞的增殖、分化并能提高NK细胞杀伤活性。全文介绍了IL-21的分子结构和生物学活性,阐述了IL-21在寄生虫感染中的作用,旨在为进一步研究IL-21在寄生虫学上的应用提供参考。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡IL-18成熟蛋白基因在杆状病毒表达系统中的双表达

为了研制针对传染性法氏囊病病毒(IBDV)的新型疫苗,将IBDV的VP2基因和鸡IL-18成熟蛋白(mChIL-18)基因分别插入到双表达载体pFastBacDual的启动子P10和PH的下游,构建重组转移质粒pFastBacDual-VP2-IL-18。将其转座入大肠杆菌DH10Bac,获得了重组杆状病毒质粒,然后在昆虫细胞Sf9中双表达VP2-IL-18蛋白,并对双表达的VP2-IL-18进行生物学活性测定。结果显示,同一细胞中能分别表达出VP2蛋白和鸡IL-18蛋白,且表达的蛋白位于细胞胞质内。当VP2-IL-18的质量浓度为200ng/mL时能刺激鸡脾淋巴细胞产生IFN-γ,IFN-γ的活性最高可达2.8×104 U/mL。当VP2-IL-18诱导产生的IFN-γ的浓度≥10U/mL时就能产生抑制水泡性口炎病毒的效果。结果表明,双表达蛋白VP2-IL-18可以产生较强的生物学活性,为研制新型传染性法氏囊病IBD疫苗奠定了基础。     

产肠毒素性大肠埃希氏菌基因工程疫苗的研究进展

简述了产肠毒性大肠埃希氏菌(ETEC)K88-K99、K88ac-LTB、K99-F41和ST-LT双价基因工程疫苗的研制方法、生产工艺、免疫效果及生态效应及其研究进展,同时阐明了用这些疫苗免疫妊娠母畜,可使吸吮了母畜初乳的幼畜的腹泻发病率和死亡率显著下降,且不会带来生态环境污染。认为这些基因工程疫苗仍有不足之处,需要进一步加以改进。     

利用杆状病毒表达系统表达猪IFN-L3及其抗PEDV活性的研究

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞上表达重组猪干扰素L3(rPoIFN-L3)进行抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的研究。首先通过间接免疫荧光和Western-blot验证rPoIFN-L3表达,并用Protein A亲和层析柱进行蛋白纯化;采用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(VSV~*GFP)检测rPoIFN-L3的抗病毒活性,含rPoIFN-L3的细胞上清的抗病毒活性为1×10~3AU/mL,纯化的rPoIFN-L3抗病毒活性为5×10~5AU/mg。进一步对纯化的rPoIFN-L3蛋白在IPEC-J2细胞上进行抗PEDV活性探究,结果显示,rPoIFN-L3可呈剂量依赖性抑制PEDV复制,并且上调相关干扰素-刺激基因(ISGs)的表达。由此证明,本研究表达的rPoIFN-L3具有抗病毒活性,并可有效抑制PEDV在IPEC-J2上的复制,对预防和治疗PEDV感染有重要意义。     

DNA分析技术在寄生虫学研究中的应用

DNA分析技术的诞生为分子生物学研究向更深更广的方向发展提供了有力的实验手段。目前这项技术已经开始在寄生虫分类、亲缘种间的进化相关性分析、寄生虫病的诊断及流行病学调查、免疫预防等方面得到应用。现概述如下。     

数据记录仪在寄生虫生态学研究中的应用简介

数据记录仪是由多接头记录器改进的记录和贮存各种数据指标的设备,适用于自然科学的各个领域。国外在80年代初就开始采用热电偶和多接头记录器技术,测定和记录微生态环境的有关气象指标,借助微机系统成功地建立了寄生虫部分属、种