猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒 2型 (PCV 2 )的ORF1基因序列 ,设计合成了 1对引物 ,对PCV 2广东株 (GD)ORF1基因进行PCR扩增 ,将扩增的ORF1基因克隆入 pMD 18 T载体 ,获得的重组质粒命名为 pMD ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核表达载体pBAD/ gⅢC得到重组子 ,命名为 pBAD/ gⅢ ORF1。序列分析表明 ,克隆的ORF1与德国分离株AF2 0 1897核苷酸序列的同源性高达 99.5 % ;与其他PCV 2株的核苷酸序列同源性为 92 .1%～99.9% ,推导的氨基酸序列同源性为 90 .2 %～ 99.5 %。同时 ,测序结果表明 ,克隆的ORF1准确插入了 pBAD/ gⅢC的多克隆位点 ,未改变读码框。用L 阿拉伯糖诱导表达 ,收集菌液进行SDS PAGE和Western blotting分析 ,结果表明PCV 2ORF1在pBAD/ gⅢC中获得了高效融合表达 ,其表达蛋白的分子质量约为 4 1ku。     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了ORF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中,筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB-ORF2。对质粒中的插入片段测序后,应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果,3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100%;它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高,达99.5%。     

两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2,并对其进行了测序与分析。结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97.3%~99.9%,与PCV2 ORF2基因的同源性为67.9%~68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明,PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV-2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析,结果表明,克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92.0%~93.3%,推导氨基酸序列的同源性为82.9%~84.6%。重组质粒pMD18-T-ORF2经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES,成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。     

PRRSV兰州分离株ORF3和ORF5基因的克隆与序列分析及其杆状病毒表达载体的构建

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中国代表株CH-1a的基因组序列,设计包含完整ORF3、ORF5基因序列的2对特异引物,利用RT-PCR技术扩增PRRSV兰州分离株(Lanzhou株)的ORF3和ORF5基因,并对其进行序列测定,同时与已发表的13株PRRSV进行同源性比较.将扩增的PRRSV Lanzhou株ORF3、ORF5基因分别克隆到杆状病毒表达载体pFastBacHTA上,将经酶切及测序鉴定的阳性重组质粒pFastBacHTA-ORF3、pFastBaeHTA-ORF5分别转化到DH10Bac感受态细胞.结果显示,ORF3、ORF5基因长度分别为765 bp、603 bp,发现核苷酸的同源性分别为88.0%～99.2%、87.3%～99.0%,获得了重组转座子rBacmid-ORF3、rBacmid-ORF5.     

猪生殖与呼吸综合征病毒N基因的扩增与克隆

应用RT PCR方法扩增出猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的核衣壳蛋白基因 (N基因 ) ,并将其克隆到 pET 32a载体 ,构建了高效原核表达载体pETN。将 pETN重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌后 ,对插入片段进行了序列测定及同源性分析。结果表明 ,插入片段序列与PRRSV美洲型ATCCVR2 332株的ORF7核苷酸序列同源性达 99.9% ,与分离毒株的同源性达 99.0 %。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达

利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析。结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B。再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1。经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21(DE3)(pLysS)感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白。用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性。     

猪圆环病毒2型2d基因型毒株的全基因组序列分析

根据Gen Bank中猪圆环病毒2型(PCV 2)基因序列,设计特异性引物,用PCR方法从福州郊区某猪场疑似PMWS仔猪病料处理后接种育传三代的PK-15细胞中扩增1个分离毒株的全基因组,并将其克隆到p MD-18T载体上,对鉴定为阳性的重组质粒送检测序。对该分离株的基因全序列及其开放阅读框2(ORF2)进行同源性分析及遗传进化关系分析。PCR鉴定结果显示,本试验中分离到的病毒属于PCV2,命名为PCV2-FZ株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组大小为1 767 bp,含有11个开放性阅读框,其中ORF2大小为705 bp,共编码234个氨基酸。PCV2-FZ株与参考毒株基因全序列的核苷酸同源性为94.3%~99.4%,与SD毒株同源性最高,为99.4%;与DK1980PMWSfree和DK1990PMWSfree毒株同源性最低,为94.3%。分离株与参考毒株ORF2核苷酸同源性为89.2%~99.4%,其中与SD毒株同源性最高,为99.4%,与DK1980PMWSfree毒株和DK1987PMWSfree毒株同源性最低,均为89.2%。全基因组与ORF2序列遗传进化树分析均表明,PCV2-FZ株属于PCV2d基因型。本研究从福建省首次分离并鉴定了1株PCV2d型毒株,这对PCV2流行病学研究和遗传变异分析具有重要意义。     

狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因在大肠埃希氏菌中的高效表达

为获得狂犬病病毒(RV)糖蛋白抗原,采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了编码RV糖蛋白的全长基因,将其克隆于pMD18-T载体,再经PCR扩增出糖蛋白全长基因和膜外区基因,将其分别亚克隆至原核表达载体pET-28a( )、pET-32a( )和pGEX-4T-1中,经PCR 和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21 (DE3)中进行表达,结果显示,克隆到pET-32a( )的糖蛋白膜外区基因表达量最高,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45．4％。经Western-blotting检测,不同载体表达的糖蛋白膜外区产物均可与兔抗RV多抗发生特异性反应,表明,重组蛋白具有良好的反应原性。     

皮蝇Hypodermin C基因的克隆及重组表达载体的构建

参照牛皮蝇HypoderminC(HC)基因的核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,以牛皮蝇总RNA为模板 ,用RT PCR扩增了牛皮蝇HC基因 ,将扩增基因进行克隆测序。测序结果表明 ,所获得基因与已知序列同源性达 99.4 5 %。同时 ,将该基因与表达载体 pGEX 4T 1连接 ,构建并获得阳性重组表达载体。     

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.     

鸭源H9N2亚型流感病毒NS基因的克隆及表达

根据GenBank中收录的H9N2亚型流感病毒的NS基因序列设计合成了 1对引物NSU/NSL ,利用RT PCR扩增出了H9N2株NS基因 ;将该基因片段克隆到 pMD 18 T载体上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果 ,获得了NS基因片段的阳性重组子 ,扩增的NS基因包含NS1基因完整的阅读框架和部分NS2基因 ,其序列与GenBank中收录的其他分离株NS基因比较 ,同源性达 96 %～ 99%。再将克隆的NS基因插入到原核表达载体 pET 2 8a后 ,转化E .coliBL2 1(DE3)感受态细胞 ,在IPTG诱导下获得了预期的蛋白表达 ,所表达蛋白质的分子质量约为 30ku。     

猪链球菌2型mrp基因ORF1序列的克隆及原核表达

根据猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因(mrp)的序列,设计并合成了1对特异性引物,以青海株的基因组DNA为模板扩增了mrp基因ORF1序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a( )中,构建了原核表达质粒pET-28a-mrp,并将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(27.0 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有MRP的抗原表位。研究结果为今后开展该病的免疫学研究奠定了一定基础。     

猪圆环病毒2型XJ-SW株全基因组的克隆与序列分析

应用PCR方法对采集自新疆沙湾地区某猪场的疑似仔猪多系统衰竭综合征病料猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组进行了扩增,确定了2份病料中的PCV2的分子特征,命名为XJ-SW1、XJ-SW2(Gen-Bank登录号:JN639856,JN639857)。经对阳性样品进行克隆、测定,并应用软件进行全基因组核苷酸序列比对分析。结果显示,2株病毒的基因组全长均为1 768nt;XJ-SW1株与我国山东DE株(GenBank登录号:HM142897)的同源性最高(为97.91%);XJ-SW2株与韩国G2284株(GenBank登录号:JF317587)的同源性最高(为97.51%)。PCV2全基因组序列的进化分析表明,2株病毒为PCV2e基因亚型;对2株病毒与5个不同基因亚型的15株病毒的ORF2氨基酸序列进行比较,结果显示,XJ-SW1、XJ-SW2在ORF2的氨基端与PCV2d同源性较高,在羧基端与PCV2e同源性较高。表明,在新疆沙湾猪场流行的PCV2毒株为PCV2e,该毒株的ORF2存在一定变异。     

长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。     

马泰勒虫EMA1基因的克隆与生物学特性分析

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物,以重组pMD-T-VP1阳性质粒为模板,扩增获得了VP1基因,通过酶切将其克隆至表达载体pQE-Trisystem上。经测序证实,重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE-VP1转化至大肠埃希氏菌M15,通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达,SDS- PAGE和Western-blot分析表明,表达产物大小与预期的结果(26 ku)一致,且具有良好的反应原性。以2 mmol／L IPTG诱导表达5 h时表达量最高,其中70％-80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中,表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

猪捷申病毒8型rVP1-ELISA检测方法的建立

为建立猪捷申病毒(PTV)抗体的间接ELISA检测方法,将PTV-8VP1基因克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta表达重组的VP1蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白分子质量约为36.2ku,且能被PTV-8阳性血清特异性识别。以纯化的重组蛋白包被ELISA反应板,建立了检测PTV抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果表明,重组VP1蛋白与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒阳性血清不发生反应。敏感性试验结果表明血清稀释至1∶800时仍检测为阳性。该方法的批内、批间变异系数均小于10%,表明具有较好的重复性。利用建立的方法对633份临床样品进行检测,阳性率是88.10%。选取58份临床样品与间接免疫荧光方法作比对试验,两者的符合率是94.80%。     

脑心肌炎病毒VP1结构蛋白的可溶性表达及鉴定

为获得可溶性表达的脑心肌炎病毒(EMCV)结构蛋白VP1片段,将EMCV VP1基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中。采用不同温度、不同IPTG浓度及不同诱导时间诱导目的蛋白表达,以筛选VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件,并通过Western-blotting检测最佳条件下表达蛋白的免疫活性。PCR、酶切鉴定及测序结果表明,VP1基因已克隆入pGEX-4T-1质粒。经优化,确定VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当D600nm值为0.4～0.6时,以0.25mmol/L IPTG于25℃条件下诱导表达12h。Western-blotting结果显示,诱导表达的蛋白具有免疫活性。