抗布鲁氏菌单克隆抗体的研制及cELISA方法的建立

利用杂交瘤技术筛选出3株抗布鲁氏菌的特异性单克隆抗体5C10、4D2和3E4;利用单抗5C10建立了检测血清中布鲁氏菌抗体的竞争ELISA(cELISA)方法。用该方法对320份牛血清样品和147份绵羊血清样品进行了检测,并与商品化布鲁氏菌病试剂盒进行了比较。结果显示,用建立的cELISA方法和商品化布鲁氏菌病试剂盒对320份牛血清样品和147份绵羊血清样品的检测符合率分别为95.6%和92.5%。用补体结合试验(CFT)进一步检测差异结果的样品(25份),证明建立的cELISA与CFT的吻合率更高(21/25),而商品化布鲁氏菌病试剂盒与CFT的吻合率较低(4/25)。结果表明,本研究建立的用于检测布鲁氏菌抗体的cELISA方法更特异敏感,在布鲁氏菌病根除计划中将具有重要的应用价值。     

应用重组猪生殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白为抗原建立I-ELISA检测方法的研究

用重组杆状病毒表达的猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白作为抗原,建立了诊断猪生殖和呼吸综合征(PRRS)的I-ELISA,与IDEXX公司试剂盒检测结果的符合率为97.3%,与间接荧光抗体试验(IFA)的符合率为100%.用该方法检测国内猪血清85份,阳性率为18.8%;能检出PRRS疫苗免疫猪6 d的血清抗体;与猪瘟、伪狂犬病、猪巴氏杆菌病、猪霉形体病阳性血清无交叉反应.     

牛布氏杆菌间接ELISA检测方法的建立

采用原核表达并纯化的布氏杆菌周质蛋白BP26作为包被抗原,建立了检测牛布氏杆菌血清抗体的间接ELISA(iELISA)方法。用建立的iELISA方法对138份临床奶牛血清样本进行了检测,并与虎红平板凝集试验(RBPT)和套式PCR(nested-PCR)进行了比较。结果表明,所建立的iELISA与RBPT和nes-ted-PCR的符合率分别为97.82%和98.55%。尽管该方法的敏感性略低于nested-PCR,但用iELISA检测病牛血清的阳性率可达93.00%。该iELISA方法可作为一种有效的牛布氏杆菌病血清学诊断的备用方法。     

猪生殖与呼吸综合征血清抗体重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

以纯化的猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)重组N蛋白作为包被抗原 ,通过对各项试验条件的优化 ,建立起检测PRRS血清抗体的重组N蛋白间接ELISA检测方法。用此方法检测了2 0 0份血清样品 ,并与IDEXX公司ELISA试剂盒的检测结果相比较 ,敏感性和特异性分别为 93%和95 % ,总符合率达 91%。 2种检测方法的结果之间差异不显著 (P >0 .0 5 )。试验表明 ,建立的间接ELISA检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点 ,可用于PRRS血清抗体的检测。     

PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒的研制及其应用

建立了一种检测猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验法(IPMA),并组装成PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒。对该试剂盒的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验,并与国外IDEXX ELISA试剂盒进行了比较。结果显示,用该试剂盒检测PRRSV人工接种猪血清样品,第1周抗体阳性检出率为50%,从第2周起抗体阳性检出率均为100%,而对照组猪血清抗体检测均为阴性。该试剂盒重复性好,-20℃保存18个月稳定,与其他病毒参考血清无交叉反应,与国外IDEXX ELISA试剂盒的符合率为83.3%。用该试剂盒对采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、上海等地13个猪场的520份正常猪血清样品进行了抗体检测,结果,4个猪场阳性率高达90%以上,仅有2个猪场为阴性,其余猪场阳性率为10%~57%。     

PRRSV M蛋白基因片段的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

利用PCR方法获得PRRSV M基因,使用原核表达系统p ET-28a(+)-BL21(DE3)诱导表达M蛋白。用表达的M蛋白建立检测PRRSV抗体的间接ELISA。通过特异性试验、阻断试验和重复性试验考查基于重组M蛋白建立的ELISA(M-ELISA)的实用性,同时使用M-ELISA和IDEXX Herd Chek ELISA for PRRSV试剂盒检测收集的400份临床血清样品。结果,用PCR扩增到了PRRSV M基因,获得了重组M蛋白,建立了用于检测PRRSV抗体的间接ELISA(M-ELISA);该M-ELISA具有良好的特异性和重复性。400份临床血清的检测结果与IDEXX试剂盒的检测结果的符合率为95.3%。上述结果表明,本研究基于表达的重组M蛋白,成功建立了检测RRSV抗体的间接ELISA。     

猪鼻支原体抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为了检测猪血清中猪鼻支原体(Mhr)的抗体水平,采用脱氧胆酸钠提取Mhr膜蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA,并采用该方法检测了60份SPF阴性猪血清和45份Mhr阳性猪血清样品。结果显示,该方法的特异性为90.5%,敏感性为98.0%。除猪肺炎支原体(Mhp)外,该方法与几种猪病毒阳性血清及副猪嗜血杆菌Ⅳ型阳性参考血清均无交叉反应。对Mhr DL菌株感染的巴马猪血清抗体的检测结果显示,Mhr感染后第3天血清抗体阳转,第35天抗体水平达到高峰,抗体效价为1∶6 400。用该方法与IDEXX猪肺炎支原体抗体检测试剂盒平行检测138份现地血清样品,Mhr和Mhp的阳性检出率分别为71.0%和44.9%。用该方法对黑龙江、吉林、山东等地临床送检的457份血清的检测结果显示,Mhr阳性率为70.3%,表明我国猪群Mhr感染十分普遍。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA具有良好的特异性和敏感性,为Mhr抗体检测提供了技术手段。     

基于PLD蛋白的伪结核棒状杆菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立以PLD蛋白为包被抗原的伪结核棒状杆菌(C orynebacterium pseudotuberculosis,C p)血清抗体间接ELISA检测方法,以原核表达得到的重组PLD蛋白作为包被抗原,并进行特异性、敏感性和重复性试验,以及对临床样本进行检测。结果显示,重组PLD蛋白大小为33 ku,Western-blot检测具有良好反应原性;建立的间接ELISA检测方法最佳抗原包被量为每孔200 ng,血清以1∶200稀释作用1 h,酶标二抗以1∶5 000稀释作用1 h,TMB显色20 min,血清阴阳性临界值为0.367。特异性试验表明,建立的ELISA方法对羊布鲁菌、产气荚膜梭菌、羊结核、羊衣原体和小反刍兽疫阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;灵敏性试验表明,当C p标准阳性血清1∶1 280稀释时检测结果仍为阳性,灵敏性良好;重复性试验表明,批内和批间变异系数分别在2.27%～8.89%和2.11%～6.92%,重复性良好。对临床采集的山羊样本进行检测与实际患病情况的符合率为96%,符合率较高。对陕西省不同羊场的643份山羊血清进行检测,C p阳性率为31%。本研究建立的C p抗体检测方法为下一步研制C p抗体ELISA检测试剂盒提供了理论基础。     

基于牛布氏杆菌重组外膜蛋白的混合抗原间接ELISA方法的建立

为建立布鲁菌的快速检测方法,通过引物设计、PCR扩增、表达载体构建、SDS-PAGE和Western-blot分析对牛布鲁菌3种外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28基因进行原核表达,利用亲和层析法纯化3种重组蛋白,将3种重组蛋白混合作为包被抗原,经重复性、灵敏度和特异性试验建立了布鲁菌抗体检测间接ELISA,并对300份牛血清样品进行检测应用,同时使用进口的商品化试剂盒进行平行检测。结果显示,成功构建了p Cold-TF/OMP19、p Cold-TF/OMP22和p Cold-TF/OMP28原核表达载体,诱导后分别表达大小分别为69、74和80 ku的可溶性且具有良好反应原性的重组蛋白r OMP19、r OMP22和r OMP28。基于此3种重组蛋白混合抗原建立的间接ELISA具有良好的重复性和特异性,其灵敏度达1∶1 600。临床样品检测试验结果显示,与进口试剂盒总符合率高达96%(288/300),其中阳性符合率为93.5%(58/62),阴性样品符合率为96.64%(230/238)。将3种重组外膜蛋白联合作为包被抗原进行牛布鲁菌抗体检测,为我国牛布鲁菌病的诊断检测技术相关研究提供了新的思路和参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的一种重要病原,GP5蛋白是病毒编码的重要免疫保护蛋白。目前,虽然PRRSV抗体检测方法较多,但尚无商品化的GP5蛋白ELISA抗体检测试剂盒。本研究根据高致病性PRRSV BB0907毒株GP5基因特性,删除了GP5基因跨膜区,并将剩余基因片段优化为大肠杆菌偏嗜性,构建了高效表达的GP5重组蛋白的原核表达载体,制备获得GP5重组蛋白。通过反应条件优化,建立了PRRSV GP5蛋白间接ELISA(GP5-ELISA)抗体检测方法,其最佳抗原包被浓度为1.0 g/m L,血清的最佳稀释度为1∶100,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和副猪嗜血杆菌(HPS)等病原抗体均无交叉反应。相对于IDEXX公司PRRSVELISA抗体检测试剂盒,本研究建立的间接GP5-ELISA的敏感性和特异性分别为90.69%和92.86%,两种方法的符合率为91.11%。用本研究建立的间接GP5-ELISA对360份临床猪血清的PRRSV抗体进行检测,抗体阳性率为74.44%。上述结果表明,本研究建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法具有广阔的应用前景。     

猪链球菌抗体GDH重组蛋白PPA-ELISA检测方法的建立

以纯化的猪链球菌重组谷氨酸脱氢酶(GDH)蛋白作为包被抗原,酶标葡萄球菌A(PPA)蛋白为二抗,建立了检测猪链球菌抗体的间接PPA-ELISA诊断方法。经方阵滴定确定了抗原的最适包被浓度为12.5mg/L,血清样品的最佳稀释倍数为1∶80,PPA-ELISA阳性反应的临界值为D450nm≥0.378,交叉反应试验结果表明,该重组抗原与其他常见的6种猪病的阳性血清不发生交叉反应,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。经与武汉科前动物生物制品有限责任公司的商品化猪链球菌抗体检测试剂盒比较,二者的符合率为96.7%;对320份血清进行猪链球菌抗体检测,阳性检出率为73.1%。试验证明,所建立的PPA-ELISA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高,为大规模地进行猪链球菌病的流行病学调查和血清学诊断提供了有效的技术手段。     

布鲁氏菌血清抗体量子点荧光微球检测试纸条的研制

为研制一种现场快速筛查布鲁氏菌病的免疫层析试纸条,本研究以量子点荧光微球作为示踪物,共价偶联布鲁氏菌外膜蛋白OMP22,并将布鲁氏菌外膜蛋白OMP28和抗OMP22的单克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线,组装试纸条。结果显示,量子点荧光微球试纸条检测阳性血清的最大稀释度为1∶512,检测布鲁氏菌病阳性血清的敏感性为99%,特异性为98%,与虎红平板凝集试验(RBPT)的符合率为99%。且与结核病、蓝舌病、病毒性腹泻、口蹄疫及小反刍兽疫血清无交叉反应。上述结果表明量子点荧光微球免疫层析试纸条检测速度快、灵敏度高、特异性强且成本低,适用于布鲁氏菌病的现场筛查。     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ATCC VR 2332 株人工单独感染3 头3 周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR 2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2 头3 周龄仔猪,每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现,并用HerdChek IDEXX 试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀,对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明,用所获得的3 株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外,用IIF检测7 头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片,其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应;对这2头猪的肺组织进行病毒分离,在盲传到第4代时Marc 145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠,且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

免疫酶组化法检测人工感染牦牛体内布氏杆菌的研究

为了确定免疫酶组化法检测布氏杆菌的临床应用价值,笔者利用甘肃省甘南州兽医站人工感染试验的牦牛,进行现场检测,并与传统的细菌分离培养法做对比试验。对每头牦牛20种组织器官的检验结果表明:免疫酶组化法对细菌分离培养法的阳性符合率为100％,但前者阳性检出率却显著地高于后者。并且用免疫酶组化法检测耗时短,操作安全、简便,因此更具有实用价值。     

流产布鲁氏菌bp26和omp10基因的同源性分析

利用布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因和omp10基因,对分离的布鲁氏菌和参考布鲁氏菌菌株进行克隆和序列分析,以明确分离的布鲁氏菌和参考布鲁氏菌菌株与基因库中的布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因和omp10基因间的同源性.根据GenBank中的布鲁氏菌bp26基因和omp10基因,分别设计合成了1对特异性引物,以提取的分离株布鲁氏...     

杆状病毒表达的猪传染性胃肠炎病毒钉状糖蛋白在其血清学诊断上的应用

利用从猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）Ｍｉｌｅｒ株（Ｍ５Ｃ）克隆建立的一株重组杆状病毒（Ｒ２－２）表达的重组ＴＧＥＶ钉状糖蛋白（Ｓ），建立了一种阻断酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）来检测猪群抗ＴＧＥＶ抗体。试验表明，用重组病毒Ｒ２－２接种ｓｆ９细胞（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）所表达的重组蛋白量在接种后第７２ｈ达到最高值；该重组蛋白能与抗ＴＧＥＶＳ蛋白Ａ位点的单克隆抗体特异性结合。用阻断ＥＬＩＳＡ检测６８份来自无ＴＧＥＶ感染或ＴＧＥＶ（Ｐｕｒｄｕｅｌ５）免疫的仔猪或母猪血清，结果与ＴＧＥＶ蚀斑减数试验完全相符，灵敏度和特异性均为１００％。同时检测来自ＴＧＥＶ试验免疫猪、美国部分地区猪群、我国进口猪以及我国国内猪群血清６２７份，阳性检出率分别为８２．６１％、６１．６２％、５８．３３％和２９．１０％；用中和试验（微量中和试验或病毒蚀斑减数试验）检测的ＴＧＥ血清抗体阳性率分别为８０．８７％、５９．６０％、５６．１１％和３０．６０％，两种方法对抗ＴＧＥＶ抗体的检出率没有显著差异。     

青海省格尔木市乳牛新孢子虫病的血清学调查

用重组蛋白GST-NcSAG1t作为ELISA诊断抗原,对格尔木市乳牛犬新孢子虫病进行了调查。结果,从35份乳牛血清样品中检出犬新孢子虫抗体阳性血清4份,阳性率为11.42%。检测结果说明,青海省格尔木市饲养的乳牛牛群中存在犬新孢子虫感染。     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

鸭疫里氏杆菌病四价灭活疫苗的研究

在全国流行病学调查的基础上 ,选择四川等地流行广泛的鸭疫里氏杆菌 (RA) 1、2、4和5血清型菌株制备铝胶佐剂四价灭活疫苗。对疫苗经无菌检验及安全检验合格后 ,给 3日龄樱桃谷商品鸭每只颈背皮下注射 0 .5mL ,第 10、13和 16d免疫鸭对同源RA的攻击分别表现出 5 %～2 0 %、75 %～ 90 %和 10 0 %免疫保护力 ,第 2 3～ 30d免疫保护力开始下降。用间接ELISA对免疫鸭进行抗体消长规律检测 ,表明 3日龄樱桃谷鸭首免后第 2 3d抗体达到高峰 ,至 93日龄时仍能检出抗体 ;10日龄时进行二免后可产生更高的抗体水平 ,到第 65d时仍能保持较高抗体水平。疫苗免疫雏鸭能够显著 (P <0 .0 5 )或极显著 (P <0 .0 1)地增强其T细胞的免疫力 ,时间达 2周。经攻毒保护试验、抗体消长规律测定、T细胞免疫水平测定和田间试验 ,证明研制的鸭疫里氏杆菌病(RAI)四价灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性 ,能有效预防RAI的发生