氯化钾浸出抗原进行牛结核ELISA的研究

作者用高浓度氯化钾自牛分枝杆菌(M.bovis)浸出细胞壁成分,通过ELISA方法证明其用作ELISA抗原有抗原活性,并比较了该浸出物与结核菌素(OT),超声粉碎茵体3种抗原的ELISA值。证明氯化钾浸出物的特异性优于超声粉碎菌体和OT。用氯化钾浸出物为抗原ELISA法检测了118头OT变态反应阳性牛和39头变态反应、病变、细菌学检查阳性牛及55头其它疾病牛血清OD位。结果表明,OT变态反应阳性牛与细菌学检查阴性牛及其它疾病牛OD值有显著差异(P<0.01)。     

牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原,建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶1600,血清稀释度为1∶60,抗原和血清、血清和二抗均在37℃反应30 min,底物在37℃显色15 min,D655 nm阴性、阳性临界值为0.5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验,表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测,结果显示,阳性血清的符合率为27.8%,阴性血清的符合率为91.7%。     

牛结核菌素变态反应的非特异性问题

当前在牛结核病诊断和牛群检疫中,各国均采用结核菌素皮内注射法,除应用普通结核菌素外,主要使用提纯或浓缩结核菌素。据书刊所载:结核菌素皮内试验的可靠性为96～98％。这在结核病疫区是可以达到的,而非疫区试验的可靠性往往低于上述指标。其原因是一些牛只被牛分枝杆菌以外的其他分枝杆菌致敏发生副变态反应;或者受非特异性因素影响发生假变态反应,致使诊断工作复杂化。近20年来,各国有关科技人员对检疫中存在的问题都较重视,特别是副变态反应问题,研究人员作了大量的科学试验工作,现将有关科研情况综述如下。     

牛蓝舌病的血清学调查

1988～1989年,对兰州军区部分军马场和牧场进行了牛蓝舌病的调查;并采用青岛动物检疫总站提供的牛蓝舌病凝胶免疫扩散诊断抗原进行了血清学抽样检测。调查结果表明我区部分牧场自1983年来牛蓝舌病呈散发,但未引起死亡。血清学抽样检测不同品种牛224头份,检出阳性19头份,阳性率8.48％。其中青海五十六基地牦牛血清65头份,阳性9头份,阳性率达13.85％;甘肃山丹军马场褐牛血清为108份,阳性8份,阳性率为7.41％;陕西北关农场奶牛血清51份,阳性2份,阳性率占3.92％。经统计学处理,不同品种的牛阳性率无显著性意义(P>0.05)。     

新疆部分地区牛新孢子虫病的血清学调查

应用间接免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验、斑点酶联免疫吸附试验3种检测方法,对新疆地区部分牛和牦牛的血清样品进行新孢子虫病抗体检测.结果显示,298头份牛血清全部为阴性,4份牦牛血清1份为阳性.     

应用虎红平板凝集试验检疫奶牛布氏菌病

虎红平板凝试验(RBPT)在家畜布氏菌病检疫中,做为一种初筛方法沿用已久。一般认为,它有较强的特异性及敏感性,故有克服非特异性反应的优点。以往我们采用试管凝集试验(SAT)对健康牛群进行布病例常检疫时,常受到非特异性反应的干扰,为了解决这个问题,在1984年6月对青岛地区某场牛群进行布病检疫时,以RBPT为主要方法,同时用补体结合试验(CFT)及SAT两种方法做为比较。为了对RBPT的敏感性及特异性作出评价,还以布氏菌牛种387菌株(BA387)、布氏猪型二号菌苗(S_2)及耶尔辛氏菌0:9菌株(Ye:0.9)接种健康奶牛制备免疫血清作为对照。现简要介绍如下。     

斑点酶联免疫吸附实验诊断猪囊虫病的研究

用Dot—ELISA法诊断猪囊虫病在国内还属首次。该法在接到病料后2.5小时内准确报告结果,结果判定不但简易直观,不需酶标检测仪,而且还可作为技术资料长期保存。以抗原制备的快诊膜在室温下保存数月不失活,可通过信封邮递,从此彻底解决了基层单位多年来需要冰箱保存抗原和多年来抗原运输中存在的一系列难题,从而更加方便了基层。本法以纤维素膜作为载体,抗原用量由常规ELISA的100μl减少为1μl,其他器材和试剂用量也较常规ELISA少,因而大大降低了检测成本。与4种寄生虫病(棘球蚴、细颈囊尾蚴、旋毛虫、弓形虫)阳性血清不发生交叉反应。对按“四部”规程肉检确认为猪囊虫阴性血清314头份,阳性血清108头份,经Dot—ELISA法检测,其阴性符合率为99.36％,阳性符合率 为99.10％,对长春市肉联厂的784头份商品猪血清和辽、吉、黑、内蒙古四省区部队的3653头份猪血清进行检测,其猪囊虫病阳性检出率分别为5.36％和4.9％,与有关资料统计结果相符。对55头份阳性血清和60头份阴性血清进行4次重复性试验,其重复率达100％。实验结果证明,该法符合“简便、快速、敏感、准确、经济”的原则,尤其易于在基层推广应用。     

牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症dot-ELISA诊断方法的建立

以纯化的菌体蛋白为诊断抗原,建立了牛D型产气荚膜梭菌特异性抗体的斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)检测方法,确定了各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1.95 μg/mL,血清稀释度为1:320,二抗稀释度为1:2000,封闭液为30 mL/L脱脂乳,抗原、血清、二抗和封闭液的作用温度及时间均为37℃30 min.用该dot-ELISA检测30份牛血清,纯化抗原比粗提抗原的阳性检出率高16.7%;dot-ELISA的灵敏度是琼脂免疫扩散试验(AGID)法的43倍;用dot-ELISA法对100份牛血清样本进行检测,阳性率为59.0%;经特异性试验、重复性试验和与AGID法比较,表明用纯化抗原建立的方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

马病毒性动脉炎血清微量中和试验的研究及应用

参照美国的马病毒性动脉炎（ＥＶＡ）诊断技术和马动脉炎病毒（ＥＡＶ）标准种毒和阳性、阴性血清，确立了ＥＡＶ在ＲＫ－１３细胞上生长的最适条件，制备了标准ＥＡＶ高免血清建立了ＥＡＶ微量中和试验。通过对进出口的５５０头份马血清抗体检测，有１９头血清抗体滴度达１４～１１２８。用标准马传贫阳性血清进行交叉中和试验未发现交叉反应；用自制的琼扩抗原进行比较试验，有８头份为阳性，证实微量血清中和试验与琼扩试验的符合率为４２．１％。     

台湾乌鸡种蛋中八种禽病抗体的检测

1992年8月,在入境 旅客行李检疫中截留一批 台湾乌鸡种蛋,共180枚。 经抽样提取卵黄液,用8种常见禽病抗原检测,从中检出禽败血霉形体(MG)、传染性法氏囊病(IBD)、传染性支气管炎(IB)、鸡白痢(PD)和禽腺病毒抗体。 (一)材料和方法 1.抗原及标准阳性血清:IBD、IB、PD、传染性喉气管炎(ILT)、禽痘(AP)和腺病毒琼扩试验抗原及阳性血清,新城疫病毒(NDV)血凝抑制(HI)试验抗原及阳性血清,MG玻片凝集试验抗原及阳性血清均由哈尔滨兽医研究所购入。     

奶牛流产衣原体OmpA抗原间接ELISA检测方法的建立

以奶牛流产衣原体外膜蛋白A(OmpA)作为抗原,筛选最佳反应条件,建立了奶牛衣原体病间接ELISA检测方法。结果显示,OmpA的最佳包被浓度为1∶320;血清最佳稀释度为1∶40;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;抗原的最适包被条件为37℃1h加4℃过夜;ELISA的阴性、阳性临界值为0.391。用本方法和衣原体间接血凝试验检测奶牛血清田间样品206份,两者的符合率为95.3%。本试验建立的OmpA-ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,可为牛衣原体病的诊断及流行病学调查提供有效工具。     

南京市初生犊牛病毒性腹泻-黏膜病血清学调查

应用血清中和试验,检测南京市部分奶牛场初生犊牛血清中牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)抗体.共检测血清3 070头份,其中阳性797头份,占25.96%;检测混合血清274批,其中阳性172批,占62.77%;同时随机测定459头份阳性血清的抗体效价,多数为18～164,最高的达到1128.     

结核菌素试验阳性猴的病理检查及病原分离鉴定

1988～1989年,我们将外购的结核菌素(TB)试验阳性的11只猴隔离饲养,再按常规方法进行人型旧结核菌素试验2次,结果其中有10只猴呈阳性反应,1只为阴性反应,后改用牛型TB试验出现阳性。将此11只阳性猴全部处死,进行了系统尸体剖检及病原分离鉴定。(一)重复试验1.试剂:①人型旧结核菌素:系卫生部北京生物制品研究所生产。批号881,规格10万U/ml。②牛型结核菌素,系中国兽药监察所生产。批号85—1,规格10万U/ml。2.重复试验方法:与初次TB试验方法相同,于猴的上眼睑皮内注射人型旧结核菌素原液0.1ml(1万单位),分别于24、48和72小时时观察判断试验结果,2次试验的间隔时间为20天。     

副结核菌苗接种牛和结核病牛对副结核菌素及结核菌素的变态反应

由于牛分枝杆菌和副结核分枝杆菌之间存在着类属变态反应原,所以给由这两种病原所引起的疾病的诊断造成了困难。为了解决副结核注苗牛和结核病牛的鉴别诊断问题,我们采用副结核菌素、结核菌素做了以下对比试验。 (一)材料和方法 1.实验动物: (1)结核病牛:选自沈阳市某结核病牛隔离场的109头结核病牛。 (2)副结核菌苗接种牛:选自鞍山市某牧场曾用吉林省兽研所研制的牛副结核热灭活菌     

以禽型提纯结核菌素诊断羊副结核病

我国对羊副结核病诊断尚未见报道。1978年中国兽药监察所研制成功的禽型提纯结核菌素(以下简称禽结素,PPD),用于羊副结核病诊断。该变态反应原与国外同类产品的效价相似,特异性高,非特异性反应小,而效价稳定,是较为理想的诊断液。我们于1982年对英国进口羊427只(其中林肯羊55只,边来羊244只,沙能奶山羊64只,土根堡奶山羊64只);河北围场屠宰场的健羊93只,共520只羊用禽结素PPD皮内变态反应、补体结合反应(CF)、病理组织学检查、细菌学检查,以及与副结素PPD(英、日)对比试验,得到满意结果。 (一)材料和方法 1.诊断液     

应用乳胶凝集试验进行猪传染性萎缩性鼻炎血清流行病学调查

采用乳胶凝集试验对我国部分地区的猪血清样品进行了猪传染性萎缩性鼻炎血清流行病学调查.结果,在检测的1004份猪血清样品中检出阳性510头份.阳性率为50.8%,其中1999年检测420份,检出阳性129头份,阳性率为30.7%,2000年检测584份,检出阳性381头份,阳性率为65.2%.同时对其中的299份血清样品用乳胶凝集试验和试管凝集试验同步检测血清抗体,结果,乳胶凝集试验检出阳性194份,阳性率为64.9%,试管凝集试验检出阳性154份,阳性率为50.5%.     

鸡结核病变态反应诊断方法的研究

鸡结核病系由禽结核杆菌引起的一种慢性传染病。鸡群一旦染患本病则能长期存在,且甚难根除。患鸡日渐消瘦,产蛋率下降,终至死亡。 关于禽结核病变态反应诊断方法的研究专著甚少。目前,国外进行变态反应诊断的判定时间是注射结核菌素后48小时,观察一次,注射侧肉髯肿胀为阳性,无变化者为阴性。我国规定的判定时间是注射结核菌素后48、72小时,观察两次,注射侧肉髯增厚、下垂、发热、呈弥漫性水肿者为阳性,肿胀不明显者为可疑,无变化者为阴性,两次可疑反应判为阳性。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

采用超声裂解的副猪嗜血杆菌菌体上清作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法.通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度80μg/mL;37℃作用2 h后4℃过夜包被,待检血清的稀释度为1:320,抗原抗体反应时间为1 h,酶标二抗稀释度为1:15 000,作用时间为1 h,底物显色时间为15 min.待检血清S/N值≥2.5时判为阳性,S/N值<2.5时判为阴性.特异性、重复性和敏感性试验以及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法的特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查.     

穴位注射治疗奶牛结核病271例的报告

1977年7月至12月和1979年5月至11月间,我们用结核菌素皮内注射和点眼相结合的判定方法,对云南中甸地区23个牛场和436户社员家中的1605头奶牛进行检疫诊断,结果诊断出阳性结核病牛293头,占被检奶牛的18.25％。抽查两头阳性奶牛,进行病理剖检、细菌分离培养和动物接种,诊断为典型的结核病牛,是由牛型结核杆菌感染所致。我们采用链霉素、异烟肼针剂注射于苏气主、副穴内,结合口服中药白芨贝母散和西药异烟肼片,治疗271例,治愈率在90％以上。现介绍于后。     

口疮病毒B2L蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

将口疮病毒(orf virus,ORFV)ORFV B2L蛋白基因克隆至原核表达载体p ET-28a(+)中进行重组B2L蛋白的诱导表达;对纯化复性后的B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测血清ORFV抗体水平的间接ELISA,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。结果,原核表达出42 ku的重组B2L蛋白。Western-blot结果表明,重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。最佳优化反应条件为:抗原包被量每孔600 ng,血清以1∶200倍稀释作用1 h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释作用30 min,TMB显色时间为10 min。在该优化条件下,D_(450)≥0.342为阳性,D_(450)0.342为阴性;特异性试验表明,此间接ELISA对其他阳性血清的检测结果为阴性;对121份阳性血清进行检测,敏感性为99.2%;重复性试验表明,批内和批间D_(450)值的变异系数分别在1.81%~6.23%和1.70%~7.45%之间。本试验建立的体系对临床上676份山羊血清样品进行检测,阳性率为99.4%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA可用于ORFV抗体的检测。