致病性猪圆环病毒基因分型三重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种同时鉴别致病性猪圆环病毒(PCV)不同型的检测方法,本研究对PCV2、PCV3、PCV4各自Rep基因进行特异性保守序列分析,建立了致病性PCV的TaqMan单重和三重荧光定量PCR检测方法。该方法能特异性区分PCV2、PCV3和PCV4,与PCV1及PRV等临床上常见的猪传染性病原均无交叉反应。建立的单重及三重PCR方法的最低检测限度均为10¹copies∕μL,组内及组间的变异系数均小于1%,表明重复性良好。对354份猪临床组织病料进行三重荧光定量PCR检测,结果显示,PCV2、PCV3和PCV4的阳性率分别为66.7%、26.8%和0;PCV2和PCV3共感染率为15.8%。结果表明,本研究建立的三重荧光定量PCR方法能准确鉴别致病性PCV,灵敏性优于普通PCR法,检测过程更高效、便捷,为致病性PCV的临床诊断及流行病学调查提供了检测工具。     

猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三重PCR检测方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2、猪伪狂犬病病毒(PRV)gD和猪细小病毒(PPV)VP2基因保守区域,设计了特异性引物,在分别建立单一病毒基因PCR检测方法的基础上,通过对3组引物的比例和浓度、dNTPs和Mg2 浓度、退火温度等条件的优化,建立了针对上述3种病毒的三重PCR检测方法。敏感性试验表明,应用该方法最低可检测到4×10-4ng/μL的PRV双链DNA模板和2×10-5ng/μL的PCV2和PPV单链DNA模板。对21份自然感染病猪样品的检测结果表明,该三重PCR检测结果与单一PCR检测的结果完全符合。试验结果显示,建立的三重PCR方法可用于3种DNA病毒的同时检测,具有快速、准确的特点,有临床应用前景。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌 (APP)外膜脂蛋白基因序列 ,设计合成了 1对特异性引物。经PCR扩增 ,APP 110标准血清型菌株均能扩增出大小为 980bp的DNA片段 ,而大肠埃希氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎霉形体和葡萄球菌等的扩增结果均为阴性。该方法检测APPDNA的敏感性可达 2pg。表明 ,此PCR方法特异性好 ,敏感性高 ,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断。     

猪圆环病毒2型及猪细小病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒2型(PPV2)均为猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的潜在致病病原。为了建立一种高效、快速、准确且能够同时鉴定PCV2和PPV2的双重PCR方法,下载GenBank已公布的多个PCV2及PPV2全基因序列并比对,针对PCV2和PPV2基因组的保守序列设计合成2对PCR引物,对双重PCR反应条件进行优化,建立了同时检测PCV2和PPV2的双重PCR方法,并对其敏感性,特异性及与普通单一PCR的符合率做出评价。结果显示,该方法能同时扩增出666 bp(PCV2)与254 bp(PPV2)的特异性片段,对阳性标准质粒pMD-PCV2和pMD-PPV2的检测限分别为1.0×10²copies/μL和1.0×10¹copies/μL,对猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒1/4/6/7型和猪圆环病毒3/4型的核酸扩增结果均为阴性。对临床疑似患PRDC的86份肺部组织样品进行检测,结果显示,PCV2阳性率为30.2%,PPV2阳性...     

马鼻肺炎病毒双重PCR分型检测方法的建立

根据GenBank中登录的马鼻肺炎病毒1、4型(EHV1、EHV4)糖蛋白B(gB)基因特异保守序列(登录号分别为AY665713、AF030027.1),各设计1对引物,建立了同时分型检测EHV1、EHV4的双重PCR方法;确定其最佳工作条件,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。结果显示,在EHV1、EHV4中分别扩增出265bp和537bp的特异性目的条带,而马流感病毒cDNA、马动脉炎病毒cDNA、马乙型脑炎病毒cDNA及马传染性贫血弱毒疫苗株cDNA均未扩增出任何条带。EHV1的DNA最低检出限为2.1pg,EHV4的最低检出限为15pg。表明本试验建立的方法具备很高的应用价值。     

猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

针对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的N基因建立检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示,本方法特异性高,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪肠病毒、伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪星状病毒等病原无交叉反应。本方法C_t值与标准模板浓度在10^8.5～10^3.5PFU/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R²)为0.994 9,直线方程为y=-3.594 9x+41.006,最低检测限为10^2.50PFU/mL。运用该方法检测PDCoV感染不同来源细胞系的病毒载量,发现的PDCoV感染宿主谱广,能感染不同来源的细胞,且在LLC-PK细胞上的复制能力最强。本研究建立的方法为PDCoV的防控提供了技术支持。     

猪博卡病毒双重PCR检测方法的建立及其应用

为了建立快速检测猪博卡病毒(PBoV)所有基因型的诊断方法,根据GenBank中公布的PBoV的不同基因型序列,对其进行同源性分析,分别设计出扩增PBoV1/PBoV2及PBoV3/PBoV4/PBoV5的引物,在分别建立单一PCR检测方法的基础上,通过对两组引物的比例、退火温度等条件的优化,首次建立了同时检测PBoV1/PBoV2和PBoV3/PBoV4/PBoV5的双重PCR方法。使用该方法对来自四川省部分猪场的18份腹泻仔猪病料进行检测。结果显示,建立的双重PCR特异性强,敏感性高,重复性好;四川省存在猪博卡病毒感染,样品中有10份为猪博卡病毒阳性,其中7份为猪博卡病毒3/4/5型,2份为猪博卡病毒1/2型,1份为猪博卡病毒1/2型及3/4/5型共感染。结果表明,建立的双重PCR能成功检测出猪博卡病毒所有基因型,并能区分PBoV1/PBoV2和PBoV3/PBoV4/PBoV5,为猪博卡病毒的诊断和预防提供了技术支持。     

用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究

根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列,设计了与PRV的 gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PRV DNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为549 bp(gB)、429 bp(gD)、366 bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重 PCR扩增,均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明,多重 PCR可以检测到 106 pg三基因缺失疫苗毒或756 pg PRV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明,以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增,均无任何条带。     

猪乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的qPCR方法在7.2×10¹～7.2×10⁸ copies/μL模板浓度区间内与Ct值呈现良好的线性关系,检测下限为7.2×10⁰copies/μL,灵敏度比普通PCR高100倍;与猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪捷申病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒4型无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.0%;对44份猪皮肤组织样品进行检测,检测阳性率为2.27%,普通PCR检测阳性率为0%。综上所述,本试验成功建立了SsPV qPCR检测方法,为SsPV的快速检测提供了可靠方法。     

猪弓形虫病特异PCR诊断方法的建立

以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法。应用人工感染的方法建立了猪弓形虫病动物模型,摸索出猪弓形虫病PCR检测的最佳条件。敏感性和特异性试验结果显示,该PCR方法最低能检测到10 个弓形虫速殖子的DNA,且与相关的8种原虫和线虫均无交叉反应,证明该PCR方法具有高度的敏感性和特异性。动物感染试验结果证明,在试验猪出现明显临床症状时(感染后第5 d),对取材的8 个组织样品用该PCR方法检测,有6个组织样品为阳性,其中检出率最高的组织为肺门淋巴结。     

猪圆环病毒2型基因型鉴别PCR检测方法的建立

采用PCR方法从猪圆环病毒2型(PCV2)山东分离株中扩增ORF2基因片段,结合GenBank中已登录的PCV2基因序列进行同源性分析及基因型鉴定,确定山东省PCV2的流行优势基因型,探讨PCV2基因的遗传变异特性。依据PCV2基因型间的差异性序列,设计、合成特异性PCR引物,建立PCV2基因型鉴别PCR检测方法,并从敏感性、特异性、重复性等方面评价其性能。结果,获得了28株PCV2ORF2完整基因,其中4株为PCV2a型,21株为PCV2b型,3株为新基因型PCV2d型,显示山东省流行的PCV2优势基因型为PCV2b。基因同源性分析表明,2000-2012年国内不同地区分离株的基因同源性为90.5%~99.8%,不同基因型PCV2存在一定形式的特有氨基酸位点序列。用建立的PCV2基因型鉴别PCR方法扩增的片段大小分别为341bp和177bp,该方法最低能检测病毒DNA的量为5ng/μL;特异性试验结果显示,该方法只对PCV2a和PCV2b的DNA扩增阳性,而对猪圆环病毒1型(PCV1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)和大肠杆菌(Escherichia coli)的扩增结果均为阴性;重复检测10次的结果均一致。结果表明,建立的PCR方法具有良好的特异性和重复性,可用于PCV2基因型的鉴别检测。     

猪圆环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

为了建立一种定量检测猪圆环病毒1型(PCV1)的实时荧光定量PCR方法,根据PCV1基因序列设计了1对特异性引物,并构建含有PCV1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测PCV1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法的标准曲线的决定系数为0.999,显示出优良的线性关系;最低可准确检测320copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%;该方法对PCV2、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等的检测结果均为阴性;对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于PCV1的检测与定量分析。     

猪附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照猪附红细胞体16 S rRNA基因序列设计了1对引物,分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体,确定特异性产物的Tm值,同时做普通PCR。试验结果表明,特异性产物的Tm值为88.5℃,最低能检测到含0.036 fg/μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR,通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化,建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性,为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

猪伪狂犬病病毒S1株的分离与鉴定

从上海某猪场发病仔猪体内分离到 1株病毒 ,该毒株能在鸡胚成纤维细胞、RK、Vero、BHK2 1、ST、PK15细胞上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化 ,克隆毒株在BHK2 1细胞上的TCID50 为 5 0 μL 10 -6.68稀释液。该病毒能被伪狂犬病毒 (PRV )阳性血清中和。接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应。电镜观察可见直径 110～ 180nm的典型疱疹病毒粒子。用该病毒接种兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状。表明该分离毒株为PRV。     

猪主要免疫抑制性疾病四重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种可以快速检测猪巨细胞病毒(PCMV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细环病毒(TTV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的四重PCR检测方法,本研究设计合成了4对特异性扩增引物,在系统性地优化反应体系、反应条件的基础上,分别对其特异性和敏感性进行验证,建立了能够快速检测以上4种病原的多重PCR方法,并对1...     

猪博卡病毒5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪博卡病毒5型NS1基因序列设计引物,建立了基于SYBR GreenⅠ的用以检测猪博卡病毒5型的实时荧光定量PCR。用该方法检测猪博卡病毒5型NS1基因,在3.64×102~3.64×107 copies/μL范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,Tm值为(83.12±0.12)℃,对猪圆环病毒(PCV1和PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪输血传播病毒(TTV1和TTV2)的核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.35%~1.24%,组间变异系数为0.43%~1.46%。此方法的建立为定量分析猪博卡病毒5型感染猪的感染程度和靶器官提供了精确检测手段。     

猪细环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

参考猪细环病毒1型(TTSuV 1)基因非编码区保守序列设计了1对特异性引物,构建含有TTSuV 1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测TTSuV 1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法标准曲线的决定系数为0.999 5,表明具有优良的线性关系;最低可精确检测63copies/μL的核酸模板;重复性试验的变异系数小于2%;对TTSuV 2、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等均检测不到荧光信号。对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于TTSuV 1的检测与定量分析。     

甘肃省酒泉地区猪伪狂犬病血清学检测

在甘肃省酒泉地区 15个未经猪伪狂犬病 (PR)疫苗免疫的规模化猪场采血清 2 5 4份 ,经PR斑点酶联免疫吸附试验 (Dot ELISA)检测 ,在 12个猪场检出PR抗体 ,检出阳性血清 48份 ,平均阳性率 18.9%。提示 ,在该地区部分猪场有猪伪狂犬病毒 (PrV)感染     

江苏省猪高热病病例主要继发感染病毒的多重PCR检测

应用建立的2个多重PCR方法,对2005~2006年收集于江苏省的211份猪高热病疑似病料进行了检测。结果,PRRSV阳性率为51.2%,PCV2阳性率为44.1%,CSFV阳性率为10.4%,PPV阳性率为3.9%,PRV阳性率为2.4%。2005年病料中PCV2阳性率为21.2%,2006年为73.2%;2005年PRRSV阳性率为38.1%,2006年为67.7%。2006年猪高热病疫情比2005年严重,PCV2和PRRSV可能在其中发挥了协同致病作用。对10个PRRSV分离株ORF5基因和Nsp2基因进行的测序表明,2006年分离株Nsp2基因中有连续87个碱基的缺失。     

犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-PCR的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。