绵羊睾丸原代细胞培养及接种羊痘弱毒后的病变观察

研究了在相同培养条件下不同培养液、不同血清和不同细胞密度对绵羊睾丸细胞生长的影响 ,并对该细胞接种羊痘弱毒后的病变情况进行了观察。结果 ,3种培养液对绵羊睾丸细胞生长的支持作用表现为MEM液 >199液 >乳汉液 ,但差异不显著 ;用犊牛血清的最适细胞密度为8.0× 10 5～ 1.0× 10 6 /mL ,用成年牛血清的最适细胞密度为 1.0× 10 6 /mL ,用绵羊血清的最适细胞密度为 8.0× 10 5/mL ;原代培养生长良好的细胞接种羊痘弱毒后出现了明显的细胞病变     

猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞中增殖规律的研究

通过孔板培养系统以及微载体和转瓶培养系统,研究了感染复数(MOI)、病毒感染时间(TOI)和病毒维持液对细胞生长和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)繁殖的影响。结果表明,MOI影响细胞生长速率和单位细胞病毒产量,TOI影响细胞对病毒的敏感程度以及胞内病毒的增殖速率;丰富的维生素、氨基酸等物质有利于病毒效价的提高;采用微载体和生物反应器系统生产TGEV,病毒效价可达11.3lgTCID50/0.2mL,比方瓶培养系统提高约100倍。     

猪流行性腹泻病毒细胞适应毒LJB-03株在三种Vero细胞上增殖效果的比较

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)细胞适应毒LJB-03株在3种Vero细胞上的增殖特性,分别以正常Vero细胞、适应无血清培养基的Vero细胞和稳定表达跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)的Vero/TMPRSS2细胞(繁殖PEDV时无须添加胰酶)为宿主细胞,繁殖PEDV LJB-03株,观察这3种细胞接毒后的病变特点和病变时间,利用空斑法比较其增殖特性,并以间接免疫荧光和电镜技术鉴定病毒的增殖。结果表明,PEDV LJB-03株在正常Vero细胞和适应无血清培养基的Vero细胞上增殖时需添加的胰酶最佳质量浓度为7ug/m L;在这3种细胞上增殖时的最佳感染复数均为0.01;PEDV LJB-03株在3种细胞上效价达到峰值的时间均为36 h,其中在正常Vero细胞上病毒效价最高为7.17×10~7PFU/m L,在Vero/TMPRSS2细胞上病毒效价为3.33×10~7PFU/m L,在无血清Vero细胞上的病毒效价为2.85×10~7PFU/m L。综上所述,正常Vero细胞上PEDV LJB-03株的病毒效价可达其他2种细胞的2倍以上,但在培养病毒时正常Vero细胞需添加胰酶和血清,因此,适应无血清培养基的Vero细胞与Vero/TMPRSS2细胞在培养PEDV LJB-03株时更具有潜力。     

鹅γ-干扰素基因真核表达载体的构建及在幼仓鼠肾细胞中的表达

将克隆在pMD18-T载体中的鹅IFN-γ基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),得到真核表达质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ,经测序鉴定后,在室温条件下,质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ浓度20μg/mL,体积400μL,幼仓鼠肾细胞(BHK-21)细胞密度1×106/mL,电穿孔仪参数设为电压425 V、电容25μF、连续脉冲2次转染BHK-21细胞,待细胞贴壁后经过浓度为600μg/mL的G418连续筛选14 d后,出现抗性细胞克隆,将阳性BHK-21细胞上清液进行Western-blot鉴定,检测结果证明鹅IFN-γ在BHK-21细胞中得到表达。     

低血清培养PK-15细胞系对TGEV增殖规律的研究

为降低疫苗生产综合成本,本研究探讨了以低血清培养基(M08011)替代常规细胞培养基(DMEM)的可行性。本研究依次采用含100、80、50、30、20、10、0mL/L血清的低血清培养基(M08011)驯化PK-15细胞,并考察猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)在低血清培养的PK-15细胞系中的增殖规律。结果显示,驯化后的PK-15细胞在含100、80、50、30、20 mL/L的低血清培养基中生长状态良好,与常规培养基所培养的PK-15细胞无差异。低血清培养体系培养PK-15细胞时,血清最低添加量为20 mL/L。用该体系培养的PK-15细胞接种TGEV后,TGEV的TCID50为10^-4.97/100μL,与常规条件培养的TGEV的TCID50为104.88/100μL相比,差别不明显。TGEV接种PK-15细胞,低血清培养基中血清浓度降低至20 mL/L,毒价未受到影响。结果表明,本研究建立的PK-15细胞及TGEV低血清培养体系可初步应用于TGEV的增殖培养,为相关疫苗研发奠定了基础。     

牦牛胎儿成纤维细胞的分离培养

采用30d胚龄左右的牦牛胚胎,用2种不同的消化液消化后,将所得的牦牛胎儿成纤维细胞(yak embryonic fibroblasts,YEF)培养于不同血清含量的RPMI1640培养液中,并接种于2种不同材质的培养瓶表面,对YEF的分离方法、培养所需胎牛血清(FBS)添加量和不同基质表面对YEF生长的影响进行了研究。结果表明,含150 mL/L FBS的RPMI1640培养基最适合YEF生长,可传代27次以上;经用RPMI1640和D-Hank’s液配制的2．5 g／L胰蛋白酶消化,所得的YEF的细胞活率差异不显著(P>0．05),其原代细胞在含100 mL／L胎牛血清的RPMI1640培养液中的贴壁率差异极显著(P<0．01);不同生长基质对YEF的形态没有显著影响。     

微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型的建立及不同阶段虫体形态的观察

利用人回盲肠癌(HCT-8)细胞作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养,观察细胞的生长状况;在培养细胞中加入1×105个经活力检测的微小隐孢子虫卵囊,培养72h后用荧光标记的隐孢子虫卵囊、子孢子染色试剂盒Crypt-a-Glo和Sporo-Glo进行染色,观察不同发育阶段的隐孢子虫形态。结果显示,在六孔培养板中接种10×105个细胞后,24h后长成80%～100%单细胞层,可以用来接种微小隐孢子虫。培养72h后观察到了隐孢子虫各个阶段虫体的形态。结果表明,成功建立了微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型。     

猪流行性腹泻病毒抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立与应用

用猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白单克隆抗体IgG包被酶标板,以纯化的PEDV作为捕获抗原,建立了PEDV抗原捕获ELISA抗体检测方法。优化后该方法的反应条件为:单克隆抗体包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h加4℃过夜;含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液作为封闭液,37℃封闭3h;捕获抗原的质量浓度为5μg/mL,37℃作用3h;被检猪血清做1∶50稀释,37℃作用1h;山羊抗猪IgG-HRP稀释度为1∶2 000,37℃作用45min;底物最佳作用时间为37℃10min。设定阴阳性血清抗体对照,计算血清样品的S/P值,S/P值≥0.37判为阳性,S/P值0.323判为阴性,介于两者之间为可疑。用建立的ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等阳性血清,结果均无交叉反应性。该方法的批间和批内变异系数均小于10%。相对国产商品化抗体检测试剂盒,其敏感性、特异性和符合率分别为94.6%、91.3%和93.3%。应用本方法检测山东、浙江和江苏省的308份猪血清样品,结果 PEDV抗体阳性率达89.29%。结果表明,建立的抗原捕获ELISA敏感性、特异性和重复性良好,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。     

环腺苷酸对体外培养的山羊乳腺上皮细胞增殖的影响

用环腺苷酸 (cAMP)对体外培养的山羊乳腺上皮细胞 (GMEC)进行试验 ,将细胞分为 8组。第 17组分别加入 1× 10、1× 10 2 、1× 10 3 、1× 10 4、1× 10 5、1× 10 6、1× 10 72nmol L的cAMP ;第 8组不加cAMP为对照组。结果显示 ,第 16组细胞倍增时间随cAMP浓度升高而递减 ,分别为 31.7、2 9.8、2 7.8、2 5 .6、2 3.8和 2 2 .0 2h ;当cAMP浓度达到 1× 10 72nmol L时 ,细胞倍增时间反而延长 2 6 .5 2h ,对照组细胞倍增时间为 30 .6 2h。结果表明 ,在一定浓度范围内 ,cAMP对GMEC有促进增殖作用 ,当cAMP浓度过高时则有抑制作用。cAMP对该细胞生长曲线的影响是在对数生长期。Westernblot结果证实 ,体外培养的细胞为GMEC ,cAMP诱导了该乳腺上皮细胞特异性产物酪蛋白的表达。     

二甲基亚砜对五指山猪精子运动速度的影响

将人工采集的五指山猪精液分为 5组 ,第 1～ 4组分别加入 0 .2、1.0、5 .0和 10 .0mL/L的二甲基亚砜 (DMSO) ,第 5组为空白对照组。各组精子终浓度为 3× 10 7～ 9× 10 7个 /mL ,于 3 7℃恒温水浴锅中温育 15min ,用浊度分析法检测快速运动相精子的速度。结果表明 ,试验浓度范围内 ,DMSO对五指山猪精子平均运动速度无显著影响。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

云南省红河州山羊流产病原的调查

针对红河州山羊妊娠期流产严重的现象 ,进行了流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、实验室诊断、人工感染试验和治疗试验。结果发现 ,妊娠母山羊流产现象覆盖全州 ,且流产率以每年 11.5 0 %的速度递增 ,弓形虫抗体阳性率为 30 .82 % (12 10 / 392 5 ) ,衣原体抗体阳性率为32 .31% (12 6 8/ 392 5 ) ,其中弓形虫和衣原体双重感染阳性羊占 9.35 % (36 7/ 392 5 ) ,未检出布鲁氏菌抗体阳性羊 ;自流产胎儿肺抹片中发现弓形虫滋养体包囊 ,7份流产胎儿中有 6份分离到衣原体 ;用土霉素及复方新诺明治疗有明显效果 ;人工感染试验能复制出与自然病例相同的病例模型。调查结果表明 ,红河州广泛流行的山羊妊娠期流产的病原是弓形虫、衣原体 ,2种病原单一感染或混合感染是造成流产的主要原因。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

朝鲜的核、导战略态势及其影响

朝鲜实施导弹发射和地下核试验,意在实现核拥有,籍以提高对美战略的筹码。朝鲜开展核战略角逐由来已久,先后展开过以守为攻;“边缘”对应;将计就计;以硬对强四个回合。角逐结果虽不乏战术上的小胜,却丧失了战略上的大胜。此番的导弹试射与地下核试验可视为第五个回合,是朝鲜核、导角逐战略“以攻为守”的转换。朝鲜执意实现核拥有纵有多种原因,却因核、导本身所拥有的“双刃剑”作用,带来于己、于他都不利的负面影响。包括:自食其言,愈加难以取信于国际社会;产生连锁反映,引发新一轮的军备竞赛;挑战核不扩散条约,难免遭到更大封杀;破坏合作气氛,延缓统一进程;置中国于尴尬境地,动摇中朝关系基础。朝鲜的“自行其事”难免遭到国际社会更加严厉的抵制。