猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究——牛肾细胞培养及其生物学性状的观察

用牛肾上皮细胞培养猪瘟兔化弱毒,生长繁殖良好,并不断从细胞中释放出来,猪瘟兔化弱毒在牛肾细胞上培养,不引起肉眼可见病变,用免疫荧光法可在接毒后6小时从胞浆中发现特异性荧光,接毒后18小时,可用家兔在细胞培养物中检出病毒。用带毒细胞传代,能促进兔毒在牛肾细胞上的适应能力,细胞传代后经3个多月培养,其间多次换液,不接毒,细胞收液的病毒滴度可稳定的达到1:20000,用盖玻片作带毒传代细胞单层培养,用姬姆萨染色镜检,可在许多细胞浆中发现原生小体样紫色颗粒,用H·E染色,可在胞浆中发现嗜伊红包涵体样颗粒,初步认为猪瘟兔化弱毒在牛肾细胞上培养,可产生包涵体。用牛肾细胞大瓶旋转培养猪瘟兔化弱毒,能生产疫苗,并可多次接毒、收毒,收毒次数达20余次,疫苗毒价可达1:50000,少数批次可达1:100000,对猪有良好免疫力,本试验1987年10月在云南生药厂已完成中试生产,先后冻干疫苗5批,一次效检50000倍合格的占80％,20000倍合格的占20％,各项检验指标符合规程要求,区域试验注射各种猪只40000余头,证明安全有效,疫苗在-18～-20℃保存1年,未见毒价下降。     

猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究——猪瘟病毒在牛肾细胞上的培养及影响毒价因素的观察

用免疫荧光法对猪瘟兔化弱毒(以下简称兔毒)在牛肾细胞上繁殖释放过程的研究证明,兔毒虽然能够在牛肾细胞上繁殖释放,但接毒后96小时,感染细胞量仅50％,培养物中毒价甚低。为此,我们对猪瘟兔毒在牛肾细胞上的培养及提高其毒价和影响毒价的因素进行了探讨。     

猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞旋转培养制造冻干苗的试验

为了克服用仔猪肾细胞生产猪瘟弱毒潜在致病的危险性,弥补猪瘟兔化弱毒乳兔苗大量剖杀动物成本高,不易控制污染的缺点,1981年11月我们开始把初生犊牛肾细胞用于猪瘟兔化弱毒培养试验,结果证明,猪瘟兔化弱毒可以在犊牛肾细胞上连续增值,猪兔效力平行试验效果良好,但是细胞产毒不稳定。1982年11月我们又开展了初生犊宇睾丸细胞培养猪瘟弱毒的试验,通过2年研究,解决了影响毒价的关键问题。于1984年11月,转入中试验阶段。     

猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究——以免疫荧光法对猪瘟兔化弱毒在牛肾细胞上繁殖释放过程观察

文献记载,猪瘟病毒的自然感染谱只限于猪属动物。在实验条件下能使不同家畜和实验动物感染,并能在多种动物细胞中繁殖,但在牛肾细胞上的繁殖、释放情况未见报告。设想如能用牛肾细胞培养猪瘟兔化弱毒(以下简称兔毒),并掌握其繁殖释放过程,对研究猪瘟牛肾细胞疫苗将具有重要     

同一份组培细胞繁殖(复制)两种病毒的研究

用同一份仔猪肾组培细胞先繁殖猪瘟病毒(中国猪瘟兔化弱毒),再繁殖口蹄疫O型病毒,猪瘟组培细胞毒兔检可达5 ×10~4ID/1毫升。O型口蹄疫细胞毒鼠测毒价可高达≥10~(8·5)“MLD_50/0.1毫升。 被猪瘟病毒感染后的细胞不发生细胞病变(cpe),大量繁殖猪瘟病毒后的细胞(即3～5次收毒后的细胞),再感染口蹄疫O型病毒,细胞病变率几乎达100％。从而说明猪瘟病毒与口蹄疫O型病毒是可以先后在同一份细胞内复制的。     

猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究——疫苗试制、检验、保存及区域试验

自1981年初开展猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究以来,先后完成了一系列基础实验。在1983年试制第1批牛肾细胞苗的基础上,又重复试生产6批苗,经效检,均合乎标准。现将疫苗试制、检验、保存及区域试验结果报告如后。材料与方法(一)种毒 系农业部成都药械厂提供的480代冻干毒和F505代兔脾毒(湿毒),经本室复壮,选择定型热兔脾脏作为种毒,要求毒价不低于2×10~(-5)ID/ml。也可选用5万倍合格的细胞毒做种毒,脾毒和细胞毒以新鲜者为佳。     

猪瘟弱毒与鸡新城疫(Ⅰ系)弱毒在同一份猪肾细胞的相互激化作用

从用同一份组培细胞繁殖两种病毒的研究获得结果后,我们又对繁殖过猪瘟弱毒的原代仔猪肾细胞再繁殖鸡新城疫Ⅰ系弱毒进行了研究。我们设想:是否可以在生产猪瘟弱毒疫苗多次收毒后的组培细胞上再生产NDV疫苗。NDV有无促进被猪瘟弱毒感染后的猪肾细     

牦牛传染性鼻气管炎病毒85-Y株回归本动物试验

1985年12月我们从病牦牛的眼、鼻分泌物中分离到一株有致细胞病变能力的病毒,经血清学鉴定,初步认定为牛传染性鼻气管炎(IBR)病毒,并定名为85-Y毒株。为明确IBR病毒85-Y毒株对牦牛的致病性,进行了回归本动物试验。 材料与方法 (一)细胞 按常规方法制备犊牛肾(BK)继代细胞供种毒传代、毒价测定、病毒回收与鉴定。 (二)种毒 取85-Y毒株第6代冻干毒(-20℃下保存150天,毒价10~5TCID_(50)/ml)按常规方法在BK细胞上连续传4代作为种毒,经-20℃～37℃冻融3次后用于接种牦牛,同     

猪传染性水泡病组织培养甲醛灭能疫苗的研究

(一)种毒来源和毒株的病原特性:采用龙海株。此株于1973年3月从龙海角尾公社发病猪采集水泡皮,用幼猪肾原代单层细胞培养分离适应获得。同时对此株病原特性进行研究,抗乙醚、一克分子浓度氯化镁在50℃中灭熊起保护作用。在猪肾、地鼠肾、猪睾丸等原代单层细胞培养中能繁殖并可以致细胞病变,但在牛肾、兔肾、鸡胚成纤维等细胞中培养,不出现病变,能否适应繁殖未进一步试验。该株病毒能被上海猪水泡病康复血清所中和(康     

猪流行性腹泻病毒细胞适应毒LJB-03株在三种Vero细胞上增殖效果的比较

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)细胞适应毒LJB-03株在3种Vero细胞上的增殖特性,分别以正常Vero细胞、适应无血清培养基的Vero细胞和稳定表达跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)的Vero/TMPRSS2细胞(繁殖PEDV时无须添加胰酶)为宿主细胞,繁殖PEDV LJB-03株,观察这3种细胞接毒后的病变特点和病变时间,利用空斑法比较其增殖特性,并以间接免疫荧光和电镜技术鉴定病毒的增殖。结果表明,PEDV LJB-03株在正常Vero细胞和适应无血清培养基的Vero细胞上增殖时需添加的胰酶最佳质量浓度为7ug/m L;在这3种细胞上增殖时的最佳感染复数均为0.01;PEDV LJB-03株在3种细胞上效价达到峰值的时间均为36 h,其中在正常Vero细胞上病毒效价最高为7.17×10~7PFU/m L,在Vero/TMPRSS2细胞上病毒效价为3.33×10~7PFU/m L,在无血清Vero细胞上的病毒效价为2.85×10~7PFU/m L。综上所述,正常Vero细胞上PEDV LJB-03株的病毒效价可达其他2种细胞的2倍以上,但在培养病毒时正常Vero细胞需添加胰酶和血清,因此,适应无血清培养基的Vero细胞与Vero/TMPRSS2细胞在培养PEDV LJB-03株时更具有潜力。     

CDV疫苗毒在Vero细胞内包涵体形成规律的研究

采用Vero细胞生产CDV(犬瘟热)弱毒疫苗是目前国内外生产CDV疫苗的主要方法。若提高CDV疫苗的效价,必须掌握细胞株的选择、培养方法、收毒时间、疫苗的保存及疫苗的使用时机。为了把好疫苗的培养及收毒时间关,我们进行了CDV疫苗毒在Vero细胞内生长规律的试验。CDV病毒可在细胞内产生包涵体,用G和HE染色后在普通显微镜下即可进行检查。本试验结果表明,CDV疫苗毒在Vero细胞中生长,从接毒后第3天     

犊牛甲状腺细胞的培养和应用

犊牛甲腺(CTh)初代细胞是一种对多种病毒敏感的细胞。W.A.Snowdon(1966)指出,对于口蹄疫病毒(FMDV)来说,CTh细胞对其的敏感性比犊牛肾细胞、仔猪肾细胞、幼仓鼠肾传代细胞(BHK_(21))、乳鼠高100～1000倍。所以自1963年以后,几乎所有的牛咽部一食道刮取物的病毒分离试验(FMD查毒试验)都采用CTh细胞。另外据W.Plowright和D.Ferris(1961)报道,作者用CTh细胞成功地分离到了用牛肾细胞、羊肾和睾丸细胞难以获得的牛恶性卡他热病毒。国内,对CTh细胞的培养和研究甚少,王则兴等(1983)曾报道过有关这方面的工作。为满足活畜进口检疫工作的需要,我们参考国外有关资料,成功地培养了CTh细胞,并试用于进口动物的检疫。     

猪瘟免疫荧光细胞中和试验的研究

笔者使用Thiverval株猪瘟弱毒,进行HC—IFCNT的初步研究。证明了该株猪瘟病毒(HCV)作为试验病毒的可行性,及其中和物接种细胞后培养温度提高到37℃,缩短终判时间到2天的可能性。试验对70日龄S5份、5～6月龄34份、7月龄44份猪瘟非免疫猪血清,进行猪瘟母源抗体的监测。结果70日龄阳性率52.3％;至5～6月龄全转阴性。7月龄44头双份血清,送本实验室与英国威桥中心兽医实验室各1份,试验结果双方一致,均阴性。对70日龄40份血清,与目前国内常规法猪瘟兔子中和试验(HC—RNT)作对比试验,阳性率分别为47.5％、42.5％。     

用间接血凝反应检测猪瘟抗体的研究

间接血凝是一种快速、灵敏、简单、可靠的血清学方法,我国兽医界,近年来已逐步应用于畜禽传染病,寄生虫病的诊断方面。笔者于1982年对这一方法进行了探索,以用作检测猪瘟抗体,当的所用抗原,系以石门系猪瘟强毒接种健康猪,采发病典型猪的淋、脾,将其磨碎冻融,浸出液经浓缩后作为抗原,致敏绵羊红细胞以检测猪瘟抗体,曾获得成功。但因来源有限,后乃改用牛肾细胞猪瘟毒作抗原,现将其试验情总结如下。     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针,建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来,而不与其他猪源病毒发生非特异反应,分别可检测到初始模板中41.8和81.5个拷贝的病毒RNA,与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近,两种方法对152份样品检测的符合率达96.9%~100%。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测,证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性,可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。     

貂传染性肠炎的研究——细胞培养灭活疫苗研制

利用NLFK细胞增殖培养MEV-S_1株病毒,无论静置培养或转瓶培养均可在接毒后72～96小时产生50％～75％CPE时收毒,对50％CPE的培养瓶在换液后继续培养至120～148小时时可收2次毒。然而,转瓶培养毒液的HA价要比静置培养的高。利用NLFK细胞增殖的MEV-S_1株毒制备的BEI灭活苗,对动物安全,免疫水貂30～60天后血清HI抗体滴度增加1～8个滴度,油乳剂苗增长的幅度更大,最高HI抗体价可达2~(10)以上。同时对NLFK细胞在MEV-S_1株增殖培养上的优点作了评论。     

牦牛IBR病毒85-Y株电镜观察及理化特性鉴定

牦牛IBR病毒85-Y株的分离,血清学鉴定及回归本动物试验已相继报道。现将对该毒株的电镜观察及理化特性鉴定的结果报告如下。 (一)材料与方法 1.细胞:供试验用的犊牛肾(BK)继代细胞系按常规方法制备。生长液含健康犊牛血清10％,乳汉液45％,199培养液45％,pH7.0～7.2。维持液为pH7.2—7.4之乳汉液。 2.种毒:85-Y株冻干毒在BK继代细胞上再传3～5代作为以下各项试验的种毒,接种细胞单层前均经3次冻融,3500rpm离心20分钟。     

卫可和泛福露益消毒剂抗猪瘟病毒试验

卫可 (Ｖｉｒｋｏｎ’ｓ)和泛福露益 (Ｆａｒｍｆｌｕｉｄ’ｓ)是英国生产的 2种兽用消毒剂 ,本试验仅在实验室条件下检测了其对猪瘟病毒的杀灭效果。1　试验材料1 .1　消毒剂卫可和泛福露益为Ａｎｔｅｃ产品 ,均由中国台湾省府泉实业有限公司提供。本试验按产品使用说明操作。1 .2　猪瘟兔化弱毒用农业部兰州生物药厂生产的猪瘟弱毒疫苗毒(Ｃ株 ) ,2 0倍稀释后用于本试验。1 .3　试验动物体重 2～ 3ｋｇ的健康兔 ,由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物场提供。1 .4　传代细胞和试剂ＰＫ 1 5细胞购自中国兽药监察所。培养细胞的营养液为…     

猪瘟中和试验方法研究

作者自1980～1986年间,对猪瘟兔体中和试验方法进行研究,结果显示了一可定性,二可定量;并同步探索出中和价与抗猪瘟强毒成正相关平行线的滴度,为猪瘟免疫防制监测提供了依据。 材料与方法 (一)中和试验用种毒系农牧渔业部成都药械厂生产的猪瘟兔化弱毒淋脾冻干毒(F488、F495代,毒价达2×10~(-4))存-15℃冰箱备用。 (二)攻强毒猪用种毒系农牧渔业部成都药械厂生产用的猪瘟石门系强毒,脱纤冰冻保     

应用单克隆抗体ELISA抑制法检测细胞培养中的猪瘟兔化弱毒

应用2种针对不同抗原决定簇的抗猪瘟兔化弱毒单克隆抗体建立了检测细胞培养中猪瘟兔化弱毒的ELISA抑制试验。对20份不同批次的猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞培养物的测定结果表明,该法可较准确地反映病毒在细胞培养中的产量;将病毒培养物置4℃、25℃和37℃3天、超声裂解、冻融3次和6次等不同方法处理对试验结果无显著影响(P>0.05);通过与兔体接种试验比较,探讨分析了猪瘟兔化弱毒疫苗生产工艺中的问题。