印第安纳型水泡性口炎病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立

利用ESE-Quant tube scanner监测平台,建立了一种基于实时荧光RT-LAMP技术的印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)快速检测方法.根据VSV-IN的G基因序列,设计6条特异性引物,在63℃条件下,进行核酸扩增,反应时间为45 min.在扩增前加入SYBR Green I染料作为反应的指示剂,以S...     

猪流行性腹泻病毒SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank上登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)株的ORF3基因序列保守型片段设计特异性引物,建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法。在4.32×102～4.22×107copies范围内,它有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异峰,无引物二聚体,熔解温度为82.23℃±0.19℃。它对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,表明其特异性强。该方法的组内变异系数为0.05%～0.87%,组间变异系数为0.32%～1.24%,重复性好。结果表明,建立的SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR为PEDV早期感染的诊断及定量分析提供了新的方法。     

猪轮状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的A群猪轮状病毒(PoRV)代表株OSU毒株序列,针对VP7基因设计了1对特异性引物,将150bp目的片段与pMD18-T载体连接构建标准品,建立了检测A群PoRV的SYBR GreenⅠreal-timePCR方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评价。结果显示,该方法在1.3×108copies/μL～1.3×102copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限为1.3×101copies/μL;用该方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪病毒性腹泻病毒均为阴性;批内及批间变异系数均低于2%。表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好。用该方法抽检58份疑似病例的腹泻病料,结果检出53份阳性,同时用普通RT-PCR和快速检测试剂盒对这些病料进行检测,结果分别检出42份和32份阳性。用这3种方法对11例已知阳性的临床粪便样品进行检测,结果建立的检测方法与其他两种方法的符合率为100%。用该方法检测PoRV细胞培养物中的病毒载量为1.0×105copies/μL。结果表明,建立的检测方法为PoRV的早期诊断、分子流行病学调查以及疫苗质量的监测等提供了新的快速检测技术。     

塞内卡病毒A SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为深入研究塞内卡病毒A的病原学及流行病学,本研究分离获得了 1株塞内卡病毒A的重庆地区毒株并将其命名为SVA-XN2021.针对VP1基因,设计了 1对特异性引物,将SVA-XN2021株编码区克隆入载体pcDNA3.1(+),构建了以重组标准阳性质粒pcDNA3.1(+)-SVA为模板的SVA的SYBR Green ...     

痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×10^9~7.58×10^2copies/μL范围内呈良好线性关系,R^2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性。临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高。结果表明,建立的痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段。     

羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列设计合成了1对引物,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测ORFV核酸的SYBRGreenⅠreal-timePCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.999;检测灵敏度可达9.4×104copies/μL;与绵羊痘病毒(SPV)不发生交叉反应,具有良好的特异性;组内Ct值相同,组间变异系数小于2%。应用建立的方法检测20份疑似羊传染性脓疱病病料,结果17份为阳性,同时用常规PCR进行检测,结果仅10份为阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可初步用于ORFV的检测。     

猪博卡病毒5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪博卡病毒5型NS1基因序列设计引物,建立了基于SYBR GreenⅠ的用以检测猪博卡病毒5型的实时荧光定量PCR。用该方法检测猪博卡病毒5型NS1基因,在3.64×102~3.64×107 copies/μL范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,Tm值为(83.12±0.12)℃,对猪圆环病毒(PCV1和PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪输血传播病毒(TTV1和TTV2)的核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.35%~1.24%,组间变异系数为0.43%~1.46%。此方法的建立为定量分析猪博卡病毒5型感染猪的感染程度和靶器官提供了精确检测手段。     

鹅肾型星状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测鹅肾型星状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据鹅肾型星状病毒的ORF1b保守序列,设计出1对引物,建立了检测该病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的Ct值与标准质粒在2.42×10^4~2.42×10^9copies/μL范围内呈良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为24.2 copies/μL;该方法特异性强,对禽流感H9N2、鹅副黏病毒、鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒均无交叉反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于2.5%。运用该方法对动物回归试验中攻毒的雏鹅的各脏器进行检测,结果显示,肾、脾和肝中病毒含量较高,其次是胰腺、肺及肠道,而心和脑中的病毒含量最低。上述结果表明,本研究成功建立了鹅肾型星状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并根据此方法检测出该病毒对肾、脾及肝具有较强的亲嗜性,为该病原致病机制研究奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立禽呼肠孤病毒(ARV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切,得到线性化转录模板DNA,将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板,用于标准曲线的制定。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域序列设计了1对特异性引物,以体外转录的RNA作为标准品,应用SYBR GreenⅠ染料法建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,制作的标准曲线定量浓度范围宽,比常规的RT-PCR敏感1×103倍,可检测到5.2×102个拷贝的标准品RNA,与NDVI、BDV、MG均不反应;从攻毒鸡的关节组织中可以检测到病毒,病毒含量为1×105~1×107个拷贝/μL。表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于ARV的检测。     

中蜂囊状幼虫病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立与应用

通过RT-PCR方法在云南中华蜜蜂体内检测中蜂囊状幼虫病毒(CSBV),该病毒主要以AmSBV-YN(GenBank ID:KX819276.1)病毒株的形式存在。为了精确鉴定、快速检测中蜂囊状幼虫病毒,根据AmSBV-YN的CDS保守区域,设计合成特异性引物并建立相对应的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的标准曲线循环域值(C_t)与标准品模板浓度在2.34×10²～2.34×10⁹copies/μL间的线性关系良好,相关系数R²为0.994,斜率为-3.118。该方法与蜜蜂残翅病毒、黑蜂王台病毒、蜜蜂以色列急性麻痹病毒不发生交叉反应,表明该方法特异性强;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于3%。所建立的荧光定量PCR方法对中华蜜蜂样品的检测结果显示,阳性率达90.0%,高于常规PCR方法的检测阳性率73.3%,说明该方法具有良好的适用性。结果表明,该方法可应用于对中蜂囊状幼虫病毒的快速检测,为中蜂囊状幼虫病的及时防控提供了有力的技术支持。     

猪环曲病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪环曲病毒(porcine torovirus,PToV)N基因的保守序列,设计合成1对针对PToV的特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅡ检测PToV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能很好地将PToV与猪伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、A群猪轮状病毒、猪瘟病毒、沙门菌和大肠杆菌区分开来,特异性强。检测PToV的N基因在8.65×101~8.65×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.998 9,扩增产物的熔解曲线分析只有1个单特异峰。所建立的实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.29%~1.30%,组间变异系数为0.45%~1.80%,重复性较好。利用该方法对采集自四川部分地区的43份临床样品进行检测,实时荧光定量RTPCR检出13份阳性样品,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结果表明建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性较强、灵敏度高,可用于该病的临床检测和流行病学调查。     

三种鸡细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立鸡细胞因子SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中三种重要的鸡细胞因子即ChIL-12、ChIL-15、ChIL-18的基因序列,以鸡3-磷酸甘油脱氢酶(ChGAPDH)基因为内参,设计特异引物扩增目的基因。将四种基因克隆至pMD18-T载体上,得到各自阳性克隆质粒,以四种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。结果显示,当标准品稀释度为1×102～1×1010 copies/μL时,四种基因的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.985。熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。应用建立的方法对堆型艾美耳球虫核酸疫苗pcDNA-Ea3-1E免疫的SPF雏鸡脾中ChIL-12mRNA和ChIL-18 mRNA的相对表达量进行检测,免疫组ChIL-12mRNA和ChIL-18mRNA的相对表达量均极显著高于空白对照组(P<0.01)。研究结果为ChIL-12、ChIL-15、ChIL-18的定量分析提供了技术平台。     

山羊关节炎脑炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测山羊关节炎脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)的快速诊断方法,本研究根据CAEV甘肃株Gag基因设计1对引物,并以含有CAEV甘肃株全基因组序列的质粒pUC57-CAEV为模板,建立CAEV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究所建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品模板在1.19×109~1.19×10^1 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997,斜率为-3.74,检测下限为1.19×10^1 copies/μL,且对痘苗病毒、山羊痘病毒均无扩增。重复性试验结果显示,批间与批内变异系数均小于1%,重复性好。本研究首次建立了CAEVGag基因的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法,为CAEV的快速检测和病毒感染预防提供了技术手段。     

I群禽腺病毒SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中Ⅰ群禽腺病毒六邻体基因的保守序列设计了1对引物,建立了检测Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的SYBR GreenⅠ荧光PCR方法.用Ⅰ群禽腺病毒阳性样品进行了特异性、敏感性和重复性试验.结果显示,该方法可检测到每个反应相当于1×102个拷贝的标准品DNA,与鸡减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、传染性腔上囊炎病毒和传染性支气管炎病毒等非Ⅰ群禽腺病毒不发生交叉反应,具有良好的重复性.对保存的3份Ⅰ群禽腺病毒的细胞培养物进行荧光定量PCR检测,结果都为阳性,检测的病毒含量为1×106～1×108拷贝/μL.表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上Ⅰ群禽腺病毒感染的检测.     

鸡Akt基因mRNA SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为快速检测鸡细胞的增殖能力,利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术,建立鸡Akt基因mRNA的定量分析方法。根据GenBank中原鸡Akt基因和鸡β-actin基因序列,设计合成特异性引物,应用RT-PCR技术从DF-1细胞中扩增出目的基因的DNA片段,并将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,构建重组质粒pMD18-Akt和pMD18-β-actin。分别以重组质粒pMD18-Akt和pMD18-β-actin为标准品建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测的标准曲线。结果显示,建立的RT-PCR标准曲线具有良好的线性关系和特异的单个峰,能够对样品进行稳定可靠的定量检测。采用本方法检测DF-1-PrP和DF-1-count细胞系的Akt基因的相对表达量,前者为1.656 9×103,后者为2.257 4×102,DF-1-PrP细胞系的Akt基因表达量明显高于DF-1-cont细胞系(P0.01),说明PrPC及Akt在DF-1细胞系中的表达量呈正相关。结果表明,本研究建立的鸡Akt RT-PCR检测方法能够通过对Akt基因的转录量进行检测而评价鸡细胞的增殖能力。     

牛共刺激分子CD80和CD86实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中牛CD80和CD86基因的序列,在保守区设计并合成各自的特异引物,并以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参,采用SYBR GreenⅠ染料以建立一种检测牛共刺激分子CD80和CD86的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。将CD80基因和CD86基因克隆至pMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明,CD80基因、CD86基因和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×102～1×108 copies/μL范围均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。证实,所建立的牛共刺激分子CD80和CD86荧光定量RT-PCR检测方法适用于临床样品的检测。     

犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速检测犬瘟热病毒的诊断方法,根据GenBank中犬瘟热病毒核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对犬瘟热病毒最低检出量为80copies/μL,是常规RT-PCR的100倍;与其他犬类病毒不发生交叉反应;组内、组间变异系数均小于5%。对收集的67份临床样品进行检测,阳性检出率为64.2%,而常规RT-PCR的阳性检出率为44.8%。研究结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR具有良好的敏感性、特异性和稳定性,为犬瘟热的早期诊断提供了技术手段。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为开发一种快速、准确、灵敏及定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对PEDV S基因的特异性引物,建立以SYBR GreenⅠ为染料的荧光定量RT-PCR检测方法,对疑似PEDV感染的临床样品进行检测并与普通RT-PCR结果进行比较.结果...     

水泡性口炎病毒N基因的克隆及其PCR检测方法的建立

根据国外发表的水泡性口炎病毒 (VSV)基因组核苷酸序列 ,设计了 2对特异性引物 ,通过RT PCR方法得到N基因。将此基因与 pGEM TEasyVector相连 ,通过蓝白斑筛选出阳性克隆 ,碱裂解法小剂量提取质粒。经测定 ,N基因与参考序列同源性高达 99%。同时根据克隆产物进行亚克隆 ,建立了VSV的PCR检测方法。