高浓度口蹄疫病毒抗原的稀释试验

用预备试验初选的 4种稀释剂a、b、c、d ,对经浓缩培养法繁殖的牛、猪O型口蹄疫病毒进行稀释 ,使其与普通毒 (对照 )浓度相当。然后将其与普通毒一起在不同温度下放置不同时间后 ,测定TCID50 ,并对测定结果进行方差分析和多重比较。结果显示 ,4种稀释剂稀释的病毒TCID50 存在显著差异 ;a和b稀释的病毒TCID50 之间无显著差异 ,但均显著高于c和d稀释的病毒TCID50 ;a和b稀释的病毒与普通对照毒的TCID50 也无显著差异。表明 ,a和b均可用于稀释口蹄疫病毒抗原 ,考虑到成本 ,宜选用b。     

三株O型口蹄疫病毒单克隆抗体的抗原识别位点分析

用抗O型口蹄疫病毒(FMDV)单克隆抗体杂交瘤细胞株(4A9、4C3、9F12)制备腹水并进行纯化,经ELISA检测,单抗4A9、4C3和9F12的腹水效价分别为1:25 600、1:102 400和1:51 200,SDS-PAGE分析显示,3株纯化单抗均以IgG重链和轻链为主,其分子质量分别约为45 ku和25 ku.单抗4A9、4C3和9F12的饱和度分别为1:40、1:40和1:1 000,叠加试验所得增值指数分别为0.27%、13.05%、13.34%,均小于50%.Western-blotting结果显示,3株单抗均可与O型FMDV结构蛋白VP1发生特异性反应.表明,此3株单抗均识别O型FMDV VP1蛋白上的同一个抗原位点,存在干扰现象.     

一种提高口蹄疫抗原和灭活疫苗热稳定性缓冲液的研制

为提高口蹄疫（FMD）抗原和疫苗的稳定性,采用正交试验设计L18(37),以溶液pH值和氯化钠、氯化镁、磷酸二氢钠、葡萄糖、精氨酸和氯化钙6种组分的质量浓度作为考察因素,以口蹄疫抗原或疫苗在37℃条件下146S抗原降解为0时保存的时间作为评价指标,以PBS(pH值8.0)作为对照,筛选对FMD146S抗原具有热稳定性作用的化学试剂。结果显示：在4℃条件下,用研制的缓冲液重悬的抗原和配制的疫苗可长期保存;在37℃条件下,与PBS比较,FMDV/OM抗原可保存63 d,FMDV/AF-72抗原可保存84 d,疫苗分别可以保存56和96 d,说明该缓冲液对FMDV抗原和疫苗具有很好的热稳定性。另外,该缓冲液配制方法简单,化学试剂易溶解,可用于大规模生产。研制的缓冲液能提高FMD抗原和疫苗在运输和保存过程中的稳定性,为保证FMD灭活疫苗质量提供了技术支撑。     

农杆菌介导O型口蹄疫病毒P12A~*3C基因转化玉米的研究

通过农杆菌介导转化法,将O型口蹄疫病毒P12A*3C基因转化到玉米自交系18-599的Ⅱ型胚性愈伤组织中,经潮霉素抗性筛选获得25株抗性再生植株。对转基因植株的PCR检测,PCR-Southern及RT-PCR检测表明,目的基因P12A*3C已经整合到玉米基因组中并得到表达。T1代植株的PCR检测表明,P12A*3C基因能稳定遗传,本研究为转基因玉米口蹄疫可饲疫苗的生产奠定了试验基础。     

应用DotELISA检测鸡白血病病毒群特异性抗原

利用斑点酶联免疫吸附试验( DotELISA) 的基本原理,根据蛋清可以直接吸附在硝酸纤维素( NC) 膜上的特点,建立了DotELISA 检测鸡白血病病毒(ALV) 群特异性抗原的方法,并与双抗体夹心酶联免疫吸附试验( DASELISA) 进行比较,两种方法具有相同的特异性和敏感性。     

利用RNA复制子融合表达口蹄疫病毒抗原表位与分子内佐剂的研究及其表达产物的免疫学分析

为了探究新型疫苗载体在口蹄疫防控中的应用,本研究构建了一种融合表达口蹄疫病毒抗原表位与分子内佐剂的RNA复制子.首先将FMDV毒株O/BY/2010 B、T表位及霍乱毒素B和α-干扰素基因构建到RNA复制子载体中,通过将复制子质粒线性化并进行体外转录,得到复制子RNA.将该RNA转染BHK-21细胞,用Western-...     

用紫外分光光度计检测口蹄疫病毒的研究

用紫外分光光度计测试口蹄疫病毒(FMDV)含量中,比较研究了PBS、Tris、含不同浓度蔗糖液和不同浓度迭氮钠液的差异性、相关性、直线回归方程及不同置信度下的方程误差.结果表明,蔗糖浓度与FMDV的吸光度值之间有显著直线负相关,以PBS和Tris为对照检测FMDV,对检测结果的不利影响甚微;在FMDV中加迭氮钠的最大量不能大于5.4 mg/L,否则无法测定FMDV的吸光度值;检测蔗糖密度梯度离心纯化的FMDV抗原,必须以相应级份的蔗糖液为对照才能准确定量.     

口蹄疫多表位疫苗的研究进展

概述了口蹄疫多表位疫苗研究的最新进展,并对口蹄疫合成肽疫苗、多表位疫苗、病毒样颗粒展示多表位疫苗和以自身蛋白质分子为载体的多表位疫苗的免疫原性进行了比较,旨在为研制高效、安全、多价的新型口蹄疫分子疫苗提供理论参考。     

口蹄疫病毒持续感染的研究进展

从口蹄疫病毒和其宿主两个方面综合阐述了口蹄疫病毒持续感染形成的原因,旨在为进一步阐明口蹄疫病毒持续感染的机理和降低持续感染对口蹄疫防控存在的威胁提供理论依据。     

口蹄疫病毒整联蛋白受体的研究进展

从组织分布、各毒株利用率、配体结合区介导感染的能力及β亚基胞质区作用等方面论述了4种整联蛋白ανβ1、ανβ3、ανβ6和ανβ8的研究进展,旨在阐明各整联蛋白决定口蹄疫病毒宿主组织嗜性的作用,并为口蹄疫病毒致病机制的研究提供理论依据。     

口蹄疫病毒结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位的预测

以口蹄疫病毒OLZ0 2株基因组序列为材料 ,采用Garnier Robson法、Chou Fasman法和Karplus Schulz法预测了其结构蛋白的二级结构 ,用Kyte Doolittle法分析了各结构蛋白的亲水性 ,Emini法预测了各结构蛋白的表面可能性 ,Jameson Wolf法预测了各蛋白的抗原指数 ,综合评价了口蹄疫病毒结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明 ,VP1蛋白含有的B细胞优势抗原表位最多 ,是研制口蹄疫基因工程疫苗的首选免疫原 ,但其他结构蛋白也含有少量的B细胞抗原表位 ,有的甚至有可能成为优势抗原表位     

口蹄疫病毒的纯化及鉴定

通过PEG 6 0 0 0沉淀 ,差速离心和蔗糖密度梯度离心等方法提取纯化了口蹄疫完整病毒粒子 (FMDV ) ,经 30g/L磷钨酸负染后电镜观察 ,FMDV 14 6S为中心黑染的圆形颗粒 ,与中心透亮的FMDV空衣壳有明显区别 ,SDS PAGE和Western blotting试验结果表明 ,FMDV 14 6S电泳出现VP1、VP2、VP3三条结构蛋白带 ,其中VP1和VP3与阳性血清发生反应出现 2条明显的条带。     

口蹄疫病毒多基因腺病毒穿梭质粒的构建

采用分步扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因P1 2A、3C蛋白酶基因和 3D聚合酶基因按正确的读码框依次连接克隆入 pGEM T载体。然后 ,将切取的目的基因亚克隆入腺病毒穿梭质粒 pShuttle CMV。构建成功的 2个重组穿梭质粒经测序鉴定 ,含有完整的目的基因表达盒 ,穿梭质粒可与腺病毒骨架载体进行细菌内同源重组 ,以产生重组腺病毒载体     

口蹄疫病毒A/WH/09株结构蛋白P1基因的克隆及其B细胞抗原表位的预测

对口蹄疫病毒(FMDV)A/WH/09株P1结构蛋白基因进行了扩增、克隆及序列测定。结果显示,FMDV A/WH/09株P1基因长2 208bp,包含完整的开放阅读框,编码736个氨基酸,其中VP1长636bp,编码212个氨基酸;VP2长654bp,编码218个氨基酸;VP3长663bp,编码221个氨基酸;VP4长255bp,编码85个氨基酸。采用DNAStar Protean软件对P1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行了综合分析,并预测其B细胞的抗原表位分布。结果表明,VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细胞抗原优势表位,VP4上也有少量潜在的B细胞抗原表位。与已鉴定的B细胞抗原表位相比,本试验所用方法预测的结果有较高的准确度,是一种较为先进的表位研究方法。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。     

口蹄疫病毒3D基因的真核表达及其表达产物的功能分析

利用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,经测序确认后将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1( )中,重组质粒pcDNA3.1( )-3D经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后转染至BHK-21细胞,用纯化的目的蛋白进行Western-blotting鉴定,并预测该3D基因表达产物的三级结构。结果显示,获得分子质量约55 ku的单一3D基因表达产物,其三级结构较为保守。利用RNA细胞内复制体系和荧光定量RT-PCR技术,证明3D基因表达产物在细胞内可促进口蹄疫病毒基因组的复制。     

A型口蹄疫病毒多抗原表位杆状病毒表达载体的构建及表达

为构建A型口蹄疫病毒(FMDV)多抗原表位杆状病毒表达载体,将A型FMDV上5个B细胞表位(VP1140-160aa、VP270-80aa、VP352-67aa、3B29-42aa和3D16-30aa)和4个辅助性T细胞表位(VP1200-213aa、VP420-34aa、3A21-35aa和3D346-370aa)通过人工合成的方法串联起来构建复合多表位基因B。然后将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB。将酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒pFastBac HTB-B转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将PCR鉴定正确的重组杆状病毒质粒利用CellfectinⅡReagent转染至Sf9细胞。通过间接免疫荧光试验和Western-blot检测表达情况。结果显示,能够得到与A型FMDV猪抗阳性血清结合的蛋白,大小约为22.3ku,与预期结果相符。结果表明,成功构建了A型FMDV多抗原表位杆状病毒表达载体,并在昆虫细胞中正确表达,为下一步蛋白纯化奠定了基础。     

口蹄疫病毒全长cDNA克隆的快速构建

利用RT PCR和 3′cDNA末端快速扩增 (RACE)技术分别扩增出包含口蹄疫病毒(FMDV)全基因组的 2个重叠cDNA片段 ,将其分别插入到载体 pcDNA3.1zeo( )和pGEM T Easy中 ,然后利用片段本身单一酶切位点将FMDV全长cDNA克隆至 pcDNA3.1zeo( )载体 ,经PCR扩增、酶切鉴定和序列测定。结果表明 ,重组质粒 (pcDNA3.1/FMDV)携带了FMDVOH/99基因组全长cDNA序列     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性分析

用灭活O型口蹄疫病毒为抗原免疫BALB/c小鼠4次后,取致敏的脾B淋巴细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,经间接ELISA法筛选,最终获得了3株抗O型FMDV的阳性杂交瘤细胞株,命名为2F1、2G7和6H4。血清学试验证明该McAbs能与FMDV抗原结合,具有高度特异性。     

口蹄疫病毒多基因片段的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

根据定点突变原理获得了包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分 2B编码区的目的基因片段 ,经SpeⅠ和HindⅢ双酶切后 ,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体 pFastBacHT连接 ,得到了重组质粒 pFB P12X3C3D。经酶切和测序鉴定后 ,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac ,经抗性及蓝白斑筛选 ,得到了含P12X3C3D多基因的重组穿梭载体 ,将其命名为Bacmid P12X3C3D ;提取其DNA并转染Sf9昆虫细胞 ,最后获得含口蹄疫病毒P12X3C3D多基因的重组杆状病毒。