MicroRNA-181a对日本血吸虫童虫抗原刺激巨噬细胞的免疫应答起负调节作用

用日本血吸虫童虫抗原SSA和miR-181a模拟物分别或共同刺激/转染RAW264.7巨噬细胞,再用实时定量PCR技术或流式细胞术分析细胞miR-181a和TNF-α等细胞因子及M1型和M2型巨噬细胞标记分子的表达变化。结果显示,日本血吸虫童虫抗原SSA刺激RAW264.7细胞后,miR-181a及IL-1β、IL-4、TNF-α、IL-10、IL-6等促炎因子上调表达,IL-13下调表达;miR-181a模拟物单独转染RAW264.7巨噬细胞后,细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和M1型巨噬细胞标记分子INOS等下调表达,IL-4和M2型巨噬细胞标记分子arg-1上调表达。巨噬细胞先用SSA刺激后再转染miR-181a模拟物,IL-1β、IL-4、TNF-α、IL-10、IL-6等促炎因子都下调表达。流式细胞术分析结果显示,miR-181a对M1型标记物CD16/32的表达起到下调作用,对M2型标记分子CD206的表达起上调作用。本研究提示miR-181a对日本血吸虫SSA抗原刺激的巨噬细胞的免疫应答可能起负调节作用,并促进巨噬细胞向M2型细胞转化。     

日本血吸虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆表达及表达产物的免疫保护效果的评估

为掌握日本血吸虫钙调神经磷酸酶B亚基(CNB)特性并评估其作为候选疫苗分子的潜力,采用PCR方法扩增日本血吸虫CNB基因,构建重组质粒pET-28a(+)-CNB,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用His-Bind亲和层析纯化获得重组蛋白rCNB。Western-blot结果显示,rCNB能被该重组蛋白免疫小鼠血清识别,具有较好的免疫原性。免疫组织化学分析表明,CNB主要分布在日本血吸虫虫体的睾丸、卵巢等生殖器官中,在表膜中也有少量分布。用重组蛋白rCNB结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,结果 rCNB诱导小鼠产生了27.93%(P0.05)的减虫率和42.93%(P0.01)的肝减卵率。结果表明,日本血吸虫CNB具有一定的免疫保护效果,为深入研究日本血吸虫钙调神经磷酸酶的生物学功能奠定了基础。     

日本血吸虫童虫部分差异表达蛋白的质谱分析

应用蛋白质双向电泳技术和质谱技术对16日龄日本血吸虫童虫的可溶性蛋白进行分离、分析,得到了2 000±69个蛋白斑点,其中500±86个蛋白斑点与血吸虫雌虫和雄虫的蛋白所共有,童虫特异呈现的蛋白斑点有26±1个。对其中20个童虫特异呈现的蛋白斑点进行质谱和生物信息学分析的结果表明,它们代表了16种蛋白;对这些蛋白进行生物学功能预测的结果表明,它们可能与寄生虫的生物合成、能量代谢、信号传导和细胞构成等相关。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt10a基因的克隆及其在童虫和成虫中mRNA表达量的变化

利用RACE技术从19日龄的日本血吸虫童虫中扩增了1个Wnt家族基因,并对其进行了生物信息学分析。同源性分析表明,该基因为日本血吸虫新基因,完整开放阅读框(ORF)长1896 bp,编码631个氨基酸,理论分子质量为73.3 ku。该基因编码的氨基酸序列具有Wnt家族蛋白的典型特征,与人、鼠Wnt10a的氨基酸序列同源性均为26%,推测为血吸虫的Wnt10a基因,命名为Sjwnt10a(Gen BanK登录号DQ643829)。利用实时荧光定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况,结果显示该基因在19日龄的日本血吸虫童虫中表达量最高,在14日龄童虫和44日龄雄虫中也有表达,但分别仅为19日龄童虫表达量的8.8%和5.0%,而在31日龄成虫和44日龄雌虫中没有检测到该基因。结果提示,童虫差异表达的Sjwnt10a基因可能对童虫的生长、发育至关重要。     

日本血吸虫重组抗原Sj GST Paramyosin 和 Sj 23对绵羊的保护性免疫试验

１９９４～１９９５和１９９７年应用日本血吸虫３类候选疫苗分别免疫绵羊，各组的减虫率、粪便虫卵减少率和组织（肝、大肠、小肠）的虫卵减少率分别是：虫体副肌球蛋白（ｎ－ｐａｒａｍｙｏｓｉｎ）组１７．４％～５５．３％，１４．６％～６８．１％和４８．９％～７６．７％；重组副肌球蛋白（ｒ－ｐａｒａｍｙｏｓｉｎ）组４１．４％～４４．２％，１５．９％～２５．１％和４１．１％～４８．０％；Ｓｊ２６谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）组５３．４％～６２．１％，１１．０％～３８．６％和１４．０％～６５．０％；ｒＳｊ２８ＧＳＴ组６１．４％～６８．５％，２２．９％～６０．０％和３９．０％～７６．０％；重组日本血吸虫２３ｋｕ大亲水区表膜蛋白（ｒＳｊ２３）组５１．２％～６６．１％，２１．９％～５８．４％和５４．３％～７６．７％。以ＥＬＩＳＡ检测免疫后的绵羊血清，３类抗原均诱发高水平的特异性ＩｇＧ抗体，表明以上疫苗具有诱发绵羊产生保护性免疫的作用。     

重组日本血吸虫中国大陆株28ku GST免疫刺激复合物对小白鼠的免疫试验

将体外重组的日本血吸虫中国大陆株２８ｋｕ谷胱甘肽Ｓ转移酶（ｒＳｊ２８ＧＳＴ）与免疫刺激复合物（ＩＳＣＯＭ）结合制备了ｒＳｊ２８ＧＳＴＩＳＣＯＭ。用含８５μｇｒＳｊ２８ＧＳＴ的ｒＳｊ２８ＧＳＴＩＳＣＯＭ及１００μｇｒＳｊ２８ＧＳＴ分别免疫ＢＡＬＢ／ｃ小白鼠,用常规ＥＬＩＳＡ检测体液免疫水平,以日本血吸虫中国大陆株尾蚴攻击后的减虫率表示免疫保护力。结果ｒＳｊ２８ＧＳＴＩＳＣＯＭ免疫组的减虫率为２５．５％,其荷虫数和空白对照组荷虫数相比有显著差异,而ｒＳｊ２８ＧＳＴ免疫组的减虫率仅为１５．２％,与空白对照组相比差异不显著;ＥＬＩＳＡ检测结果,ｒＳｊ２８ＧＳＴＩＳＣＯＭ免疫组比ｒＳｊ２８ＧＳＴ免疫组不仅抗体水平高,而且持续时间长     

日本血吸虫重组多表位核酸疫苗的构建与免疫保护效果评估

为构建重组日本血吸虫多表位核酸疫苗,并通过小鼠免疫保护试验比较不同重组多表位疫苗诱导的免疫保护效果,筛选并以PCR方法扩增日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)、谷胱甘肽-S-转移酶(Sj28GST)的抗原表位和23ku膜抗原大亲水区(LHD-Sj23)的编码DNA片段,构建了pCMV-LHD-Sj23-BSj28,pCMV-BGCP-LHD-Sj23,pCMV-BGCP-LHD-Sj23-BSj28三种日本血吸虫多表位核酸疫苗;采用肌肉注射法接种昆明系小鼠;用日本血吸虫尾蚴攻击感染后,剖杀小鼠,计算减虫率。结果显示,3种重组的真核表达质粒在免疫小鼠中分别获得了6.30%,14.76%和64.95%的减虫率。表明该重组多表位核酸疫苗可诱导较高的免疫保护效果,获得的三价核酸疫苗pCMV-BGCP-LHD-Sj23-BSj28具有潜在的应用价值。