DNA条形码技术在兽医寄生虫学研究中的应用

阐述了DNA条形码的概念、DNA条形码基因的筛选方法、DNA条形码的优势与劣势和分析方法,概述了近几年DNA条形码在兽医寄生虫方面的应用情况,旨在引起广大读者对该技术的关注。     

吕氏泰勒虫TlSP重组亚单位疫苗免疫保护效果的评估

为了评价吕氏泰勒虫表面蛋白Tl SP(Theileria luwenshuni surface protein)的免疫保护效果,分别用150 g/只和300 g/只乳化后的Tl SP蛋白免疫试验Ⅰ组和Ⅱ组绵羊,对照组为等量PBS,每组5只。二免后第14天,每只绵羊用50只青海血蜱饥饿成蜱进行攻蜱试验。结果显示,对照组绵羊攻蜱后出现跛行、体温2次升高和淋巴结肿大等症状,发病率为100%,死亡率为40%,染虫率在2.23%~3.50%之间;试验Ⅰ组和Ⅱ组绵羊免疫后产生的最高抗体效价分别为1∶102 400和1∶25 600,发病率均为60%,表现轻度临床症状而未发生死亡,染虫率在1.23%~1.89%之间。上述结果证实,制备的Tl SP重组亚单位疫苗在抗泰勒虫感染上具有良好的免疫保护效果,为进一步开展羊泰勒虫病亚单位疫苗的研制奠定了实验基础。     

羊泰勒虫病人工感染试验

在实验室条件下用采自甘肃省临潭县的青海血蜱饥饿成蜱人工叮咬绵羊,使其感染泰勒虫并发病,观察其虫血症、临床表现、血液学变化及病理剖检变化.结果,试验羊普遍出现稽留热、贫血、体表淋巴结肿胀等症状;血红蛋白含量从85 g/L降到40 g/L,红细胞总数从12.0×1012降到1.5×1012;内脏器官有不同程度地肿胀、出血;本病的潜伏期为22-28 d,红细胞染虫率最高可达39%.     

青海血蜱生活史的观察

对采自天然草场上的青海血蜱在实验室进行了生活史观察。结果 ,青海血蜱生活史较长 ,为三宿主蜱 ,1个生活周期为 13 8～ 2 17d ,1年 1个世代。幼蜱、若蜱的吸血期、蜕变期皆随季节和温度不同而有差异。饱血雌蜱的产卵前期和产卵期随温度不同而有差异 ,并随不同月份有明显的生殖滞育现象。另外 ,还对各期饥饿虫体的寿命和量度进行了观察     

伯氏疏螺旋体外膜蛋白C的表达及抗原性分析

以伯氏疏螺旋体SZ(B.garinii)、BO23(B.afzelii)、B31(B.burgdorferi sensu stricto)菌株的外膜蛋白OspC基因为靶基因,将PCR扩增出的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中构建重组质粒进行表达,表达的蛋白用MagneGSTTMProtein Purification System纯化,之后用此3株菌株免疫羊制备的阳性血清做Western-blot,检测该重组蛋白。证明这3个基因型菌株的重组OspC具有抗原性及交叉反应性。本研究表达的重组蛋白OspC(SZ菌株)为建立羊体内伯氏疏螺旋体抗体的ELISA检测方法奠定了基础。     

羊源巴贝斯虫未定种甘肃敦煌株的发现

采用动物接种法将采自甘肃敦煌的15只绵羊血液混合后感染1只除脾绵羊,感染后逐日做血涂片检查。结果显示,在感染后第10天的血片上出现了1种大型巴贝斯虫。虫体形态以双梨子形、单梨子形、圆形及卵圆形为主。在感染后第12天,感染羊体温升至41.1℃。染虫率达到0.125%,之后逐渐下降。无菌采集该羊血液,提取全血基因组,用梨形虫通用引物进行PCR扩增全长18SrRNA基因,得到长约1 700bp的片段,将其克隆并测序(登录号:HQ730762),与GenBank中的其他巴贝斯虫的序列进行比较,发现其与新疆巴贝斯虫未定种的同源性最高,达到99.8%。本研究发现甘肃敦煌又是一个新疆羊巴贝斯虫未定种的疫源地。     

边缘无浆体MSP5重组抗原间接ELISA检测方法的建立

将边缘无浆体MSP5基因在大肠杆菌DH5α中表达,获得45 ku的融合蛋白.Western-blot检测证实该表达蛋白具有良好的生物学活性.以纯化的融合蛋白为抗原,建立了边缘无浆体MSP5的间接ELISA检测方法.该方法对边缘无浆体阴性、阳性血清(各100份)的阳性检出率和阴性符合率分别为100%和98%,与双芽巴贝虫、大巴贝虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、衣原体、血吸虫和羊肝片吸虫的阳性血清无交叉反应,与羊无浆体阳性血清有交叉反应.结果表明,建立的间接EHSA方法具有良好的特异性和敏感性.     

羊泰勒虫中国株裂殖子的蛋白分析

采用SDSPAGE和Westernblotting试验对羊泰勒虫临潭株、隆德株、张家川株和夏河株裂殖子蛋白进行了分析。SDSPAGE结果显示,羊泰勒虫临潭株与隆德株的亲缘关系较近;张家川株与夏河株的亲缘关系也比较近。4个虫株的阳性血清分别与4个株裂殖子蛋白的Westernblotting试验结果表明,4个株虫体的阳性血清与临潭株和张家川株的裂殖子蛋白在38ku处有共同反应。提示38ku蛋白多肽有望成为特异性诊断抗原,为重组疫苗的研究提供依据。     

微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库的构建

为了研究微小牛蜱功能性抗原基因,从微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱中提取总RNA并分离纯化mRNA。采用Oligo(dT)引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ、HindⅢ定向接头,用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体。经体外包装,成功构建了我国微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库,铺板测定原始库容量为4.5×105PFU,扩增后的滴度为7.2×1010PFU/mL。     

中华泰勒虫MPSP基因的原核表达及反应原性分析

用生物信息学方法,对中华泰勒虫的梨浆虫主要表面蛋白(major piroplasm surface proteins,MPSP)基因的核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列进行了分析,并对该蛋白的抗原表位、信号肽以及跨膜区进行了预测。设计特异性引物,对中华泰勒虫MPSP基因进行了克隆和原核表达,并对融合蛋白的反应原性进行了分析。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白的分子质量约为38ku,分布于上清中。Western-blot试验表明,融合蛋白仅与抗His标签蛋白的单克隆抗体、中华泰勒虫阳性血清、瑟氏泰勒虫阳性血清、环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与其他泰勒虫、巴贝斯虫和绵羊无形体阳性血清不发生反应。这些结果表明,中华泰勒虫MPSP可作为ELISA诊断方法的候选抗原。