肺泡巨噬细胞在猪链球菌2型引致肺炎过程中的作用

为探明肺巨噬细胞在猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)引致肺炎过程中发挥的作用,用SS2体外感染4周龄SPF巴马小型猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),首先以10倍递增的SS2∶PAM感染比(MOI)分别为1∶10～1 000∶1感染12h;其次以MOI=100∶1分别感染1、2、4、6、12、24h,ELISA检测三种主要炎性细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的质量浓度及动态变化,同时光镜观察PAM的形态变化。结果显示,三种细胞因子具有相似的动态表达趋势,其表达量均随MOI升高和作用时间的延长而上升,与对照组之间均差异极显著(P<0.01),菌液浓度之间和时间点之间均差异显著(P<0.05);同时PAM的形态异常和崩解死亡比例依次增多,表明三种炎性因子的表达量与SS2的浓度和感染时间之间呈正相关;受损或濒死细胞比例亦正相关;提示三种炎性因子由受损细胞或濒死细胞产生。MOI为1∶1感染12h,或MOI为100∶1感染6h的条件下均可致70%的PAM崩解死亡,表明此条件下SS2可摧毁由PAM构筑的第一道防线。三种炎性细胞因子表达最高峰的条件是MOI为100∶1,感染12h,此时镜下细胞几乎全部崩解死亡,表明PAM的完全死亡伴随炎性因子的最大释放,炎症随吞噬功能的完全丧失而开始。结果表明,在SS2引致肺炎过程中,AM的作用是炎症的起始者,而不是抵御细胞。     

两株不同血清型禽源多杀性巴氏杆菌的理化特性研究

禽源多杀性巴氏杆菌Ｐ１０５９（８∶Ａ 型） 和Ｃ４８１（５∶Ａ 型） 对营养的需要较高,在一般培养基上生长不良,相比之下,Ｃ４８１比Ｐ１０５９ 生长更差,但在胰蛋白胨肉汤和加５ ｍ Ｌ／Ｌ 血清的普通培养基中两株菌均生长丰盛;两株菌的生长曲线显示,Ｃ４８１在对数生长期的繁殖速度较快,最高菌数略低,但衰落期细菌死亡速度较慢;对培养基中ＮａＣｌ 含量的要求,Ｃ４８１ 为０ ～２ ．７ ％ ,Ｐ１０５９ 为０ ．９ ％ ～２ ．１ ％ ;对ｐＨ 的要求,Ｃ４８１ 为７ ．４ ～７ ．８ ,Ｐ１０５９ 为７ ．０ ～７ ．４ ;两株细菌用小白鼠连续传５ 代复壮后,对小白鼠的最小致死量（ ＭＬＤ） ,Ｃ４８１为６ 个菌,Ｐ１０５９ 为９ 个菌。     

致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种灵敏、特异、快速地检测食品中致病性沙门菌的方法,针对沙门菌致病性菌株特有的invA基因设计引物,PCR扩增目的片段,构建重组质粒pMD19-T-inv285,将其作为标准品进行real-time PCR反应体系的优化和标准曲线的绘制,并进行灵敏度、特异性及稳定性检测;同时用该方法对90份肉品样品进行检测。结果显示,建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程为y=-3.397 1 x+27.313,相关系数r2=0.999 6。该方法的灵敏度为5×100copies/μL,是普通PCR(5×102 copies/μL)的100倍。对10种常见食源性细菌的检测结果均为阴性;组内和组间重复试验的变异系数均低于1%。对90份肉品样品的检出率(6/90,6.67%)显著高于快速MALDI-TOF-MS法和传统的细菌分离鉴定方法(均为3/90,3.33%)。结果表明,本试验建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR灵敏度高,且特异、稳定,适用于食品中致病性沙门菌的快速检测。     

亚硝基胍诱变巴氏杆菌基因突变株的生长表现及其毒性试验

亚硝基胍诱变巴氏杆菌基因突变株的生长表现及其毒性试验１）胡永浩汪清曾巧英于风刚沈正达（甘肃农业大学动物医学系兰州７３００７０）微生物分子遗传学研究表明，病原菌通过诱变使ＤＮＡ分子结构中的某一位点发生改变而形成基因突变菌株。基因突变的类型多种多样，营养...     

牛结核病PPD_B-P_(E-C)-IFN-γ诊断方法的建立

对结核分枝杆菌复合群致病菌株的特异性抗原ESAT-6(PE)和CFP-10(PC)分别进行原核表达并纯化。用PPDB、PE、PC和PE-C(PE、PC等量混合)作为4种刺激抗原(以PPDB作为参照),分别体外平行刺激56份已知的牛结核病阳性牛全血和460份阴性牛全血,孵育、收获血浆,采用间接ELISA检测产生的IFN-γ水平。经统计学分析,绘制ROC曲线,分别确定PPDB-IFN-γ、PE-IFN-γ、PC-IFN-γ和PE-C-IFN-γ的阳性判定最佳临界点及其敏感性和特异性;并据此进一步分析PPDB分别与PE、PC或PE-C联用(PPDB-PEIFN-γ、PPDB-PC-IFN-γ、PPDB-PE-C-IFN-γ,串联和并联)的敏感性和特异性。结果显示,PE、PC的分子质量分别为27.8ku和16.4ku;PPDB-IFN-γ的最佳临界点为0.02,其敏感性和特异性分别为94.6%和92.2%,PE、PC、PE-C的最佳临界点相同,均为0.01,其中PE-C-IFN-γ的敏感性和特异性最高,分别为92.9%和95.7%;联用时,PPDB-PE-C-IFN-γ的敏感性和特异性最高,其串联时敏感性和特异性分别为89.3%和96.5%,并联时分别为98.2%和91.3%。PE-C-IFN-γ的敏感性比PPDB-IFN-γ低1.7%,但特异性高3.5%;PPDB-PE-C-IFN-γ并联时,敏感性比PPDB-IFN-γ高3.6%,串联时特异性比PPDB-IFN-γ高4.3%。结果表明,本试验建立的PPDB-PE-C-IFN-γ诊断方法具有高敏感性和高特异性,具有极大的应用价值。     

奶牛分枝杆菌的分离鉴定与耐药性分析

为优化分枝杆菌PCR诊断方法并监测牛分枝杆菌耐药性,本研究采用罗氏培养基自奶牛淋巴结和肺中分离分枝杆菌,优化本课题组建立的两级多重PCR方法用于分离菌株的分子诊断。一级PCR为两重PCR,靶标16SrRNA进行属和群的鉴定;二级PCR为七重PCR,根据结核分枝杆菌复合群(Mycobacte-rium tuberculosis complex,MTBC)成员染色体缺失区域的差异,设计了7对引物,依据群内不同种各自呈现特定的扩增谱型进行种的鉴定。对MTBC分离株,全菌水平用绝对浓度法对4种抗结核一线药物(RFP、INH、EMB、SM)进行药敏试验;分子水平用PCR扩增耐药基因rpoB、katG、inhA、embB、rrs,并测序分析。结果显示,本试验共分离出14株分枝杆菌,一级PCR鉴定均为分枝杆菌属成员,其中8株为MTBC成员。二级PCR中,这8株均呈现相同的扩增谱型,均为牛分枝杆菌谱型。药敏试验和耐药基因检测结果一致,8株牛分枝杆菌分离株对4种抗结核病一线药物全部敏感,基因序列分析未见突变。结果表明,本研究优化的两级多重PCR方法具有快速可靠和低成本的优势,是目前国内最新的分子诊断方法。     

重组蛋白P60与LLO对单核细胞增多性李斯特菌灭活疫苗的免疫增强效果

为增强单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)灭活疫苗的免疫效果,对单增李斯特菌入侵相关蛋白(P60)基因进行了克隆、表达及纯化,分别与低剂量李斯特菌溶血素O(LLO)、单增李斯特菌灭活菌混合,以MontanideISA206为佐剂制成疫苗,皮下接种家兔,并设灭活疫苗免疫组和PBS对照组,定期检测3组家兔的血清抗体、IL-4和IFN-γ水平的变化;二免后第21d每只家兔腹腔注射2×108CFU单增李斯特活菌攻毒,观察各组家兔的发病情况,每隔24h检测一次细菌在各组家兔体内的繁殖率。结果表明,添加P60和低剂量LLO重组蛋白的单增李斯特菌灭活疫苗免疫组家兔二免后抗体水平明显高于其他各组,且能诱导Th细胞向Th1型分化,抑制Th2型细胞的分化,调节抗原特异性免疫应答,能有效抵抗单增李斯特菌的感染,使细菌在家兔体内(外周血、脾)的几何增长率从64.69%降到24.06%,免疫效果明显优于灭活疫苗单独免疫组。证明P60和低剂量LLO能增强灭活疫苗的免疫保护效果。     

猪链球菌2型MRP-FBP串联表达蛋白对小鼠的免疫保护力

针对猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)和纤维蛋白原结合蛋白(FBP)抗原性较强的基因片段,分别设计了1对引物,用PCR扩增出了mrp基因和fbp基因的片段.利用这些片段分别构建了原核表达载体pET32a-mrp、pET32a-fbp和pET32a-mrp-fbp.将这些表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行了表达.SDS-PAGE分析表明,表达的MRP、FBP、MRP-FBP的分子质量分别为47、52、80 ku.Western-blot分析表明,重组蛋白MRP-FBP可被SS2阳性血清所识别.免疫保护试验表明,串联表达的融合蛋白MRP-FBP对BALB/c小鼠的保护率达80%,是目前筛选到的制备SS2亚单位疫苗保护力最高的短片段串联免疫原.     

猪链球菌2型胞外因子短片段的原核表达及其免疫保护力

以江苏分离株HA9801基因组DNA为模板,扩增猪链球菌2型(SS2)胞外因子ef基因的1423～2203 bp片段,并将其亚克隆至表达栽体pGEX-4T-1上,构建了重组质粒pGEX-4T-1-ef.将鉴定阳性的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导8 h,表达的融合蛋白rGST-sEF大小为56 ku,以包涵体形式存在.Western-blotting显示,rGST-sEF能与全菌兔抗血清发生特异性反应.用自制rGST-sEF亚单位疫苗免疫新西兰兔.以最小致死量HA9801攻击,保护率为60%.结果表明,表达的融合蛋白rGST-sEF具有良好的免疫原性和免疫反应性.     

长角血蜱MLC基因的原核表达及表达产物的免疫原性分析

为了解长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)肌球蛋白碱轻链(MLC)基因表达产物的免疫学活性,利用RT-PCR方法扩增了长角血蜱MLC基因的完整开放阅读框,将该基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中进行表达,在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导条件下,用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,该重组蛋白的表达分子质量为44ku。Western-blotting结果显示,MLC蛋白能被兔抗长角血蜱成蜱阳性血清识别,表明MLC蛋白具有良好的反应原性。