伯氏疏螺旋体外膜蛋白C的表达及抗原性分析

以伯氏疏螺旋体SZ(B.garinii)、BO23(B.afzelii)、B31(B.burgdorferi sensu stricto)菌株的外膜蛋白OspC基因为靶基因,将PCR扩增出的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中构建重组质粒进行表达,表达的蛋白用MagneGSTTMProtein Purification System纯化,之后用此3株菌株免疫羊制备的阳性血清做Western-blot,检测该重组蛋白。证明这3个基因型菌株的重组OspC具有抗原性及交叉反应性。本研究表达的重组蛋白OspC(SZ菌株)为建立羊体内伯氏疏螺旋体抗体的ELISA检测方法奠定了基础。     

羊源巴贝斯虫未定种甘肃敦煌株的发现

采用动物接种法将采自甘肃敦煌的15只绵羊血液混合后感染1只除脾绵羊,感染后逐日做血涂片检查。结果显示,在感染后第10天的血片上出现了1种大型巴贝斯虫。虫体形态以双梨子形、单梨子形、圆形及卵圆形为主。在感染后第12天,感染羊体温升至41.1℃。染虫率达到0.125%,之后逐渐下降。无菌采集该羊血液,提取全血基因组,用梨形虫通用引物进行PCR扩增全长18SrRNA基因,得到长约1 700bp的片段,将其克隆并测序(登录号:HQ730762),与GenBank中的其他巴贝斯虫的序列进行比较,发现其与新疆巴贝斯虫未定种的同源性最高,达到99.8%。本研究发现甘肃敦煌又是一个新疆羊巴贝斯虫未定种的疫源地。     

甘南藏族自治州部分地区牦牛泰勒虫病的血清学调查

为了解甘肃省甘南藏族自治州牦牛泰勒虫的感染状况,采用可同时检测3种牛泰勒虫感染的重组MPSP蛋白间接ELISA方法,对采自甘南藏族自治州合作市、夏河县、碌曲县和玛曲县的320份牦牛血清样品进行了检测。结果显示,血清抗体阳性率为71.56%(229/320),表明该地区牛泰勒虫感染严重。SPSS22.0.0.0软件卡方检验分析结果表明,甘南藏族自治州这4个县(市)之间牦牛血清抗体阳性率无显著性差异(P=0.11,x~2=2.39,df=3),不同年龄段及不同性别牦牛之间阳性率也无显著性差异(P=0.09,x~2=2.13,df=2;P=0.07,x~2=0.02,df=1)。本研究为该地区牦牛泰勒虫病的防控工作提供了流行病学参考数据。     

青海血蜱幼蜱cDNA表达文库的构建及其保护性抗原基因的免疫学筛选

采用常规方法构建了青海血蜱幼蜱cDNA表达文库,初级文库的库容量为5.0×105PFU/mL,扩增后的库容量为8×109PFU/mL;用兔抗青海血蜱幼蜱阳性血清对该文库进行了免疫学筛选,对阳性噬菌体进行了亚克隆,提取质粒后转化宿主菌JM109,最终共得到幼蜱基因11个,分别命名为HqL1、HqL2、HqL3、HqL4、HqL5、HqL6、HqL7、HqL8、HqL9、HqL10、HqL11。测序分析表明,其中的6个为新基因。分析发现HqL7、HqL8、HqL9和HqL11具有较高的研究价值。     

中华泰勒虫MPSP基因的原核表达及反应原性分析

用生物信息学方法,对中华泰勒虫的梨浆虫主要表面蛋白(major piroplasm surface proteins,MPSP)基因的核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列进行了分析,并对该蛋白的抗原表位、信号肽以及跨膜区进行了预测。设计特异性引物,对中华泰勒虫MPSP基因进行了克隆和原核表达,并对融合蛋白的反应原性进行了分析。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白的分子质量约为38ku,分布于上清中。Western-blot试验表明,融合蛋白仅与抗His标签蛋白的单克隆抗体、中华泰勒虫阳性血清、瑟氏泰勒虫阳性血清、环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与其他泰勒虫、巴贝斯虫和绵羊无形体阳性血清不发生反应。这些结果表明,中华泰勒虫MPSP可作为ELISA诊断方法的候选抗原。     

小亚璃眼蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的边缘革蜱4D8基因序列设计1对引物,采用PCR技术自半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺cDNA表达文库中扩增获得了4D8基因;将其连入pMD18-T载体,构建重组克隆载体pMD18-Hyaa4D8.测序分析表明,克隆的小亚璃眼蜱4D8基因与边缘革蜱4D8基因的核苷酸序列的同源性为89.2%.将此片段定向亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Hyaa4D8,表达并纯化重组蛋白,通过免疫印迹试验鉴定该重组蛋白的生物学活性.结果显示,该重组蛋白是分子质量为45ku的融合蛋白,且表达产物能被半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺抗原免疫兔血清识别.     

八种杀蜱药物与球孢白僵菌分生孢子的生物相容性

为探索绿色高效的杀蜱新制剂,采用营养液萌发法和平板生长法测定了8种杀蜱药物与球孢白僵菌分生孢子的生物相容性.结果显示,这8种药物与白僵菌的相客性和药物浓度呈负相关,次亚致死剂量的苦皮藤素、灭幼脲和溴氰菊酯与白僵菌的相容性良好,萌发率均在85%以上;用浸渍法测得白僵菌孢子浓度在1×107/mL时对蜱的致死率可达100%.结果表明,所试验的8种药物中,苦皮藤素、灭幼脲和溴氰菊酯可与白僵菌配伍使用;白僵菌的最佳使用浓度为1×107/mL.     

吕氏泰勒虫TlSP基因多态性免疫区在毕赤酵母中的高效分泌表达

为研制具有完整抗原性和天然结构的吕氏泰勒虫表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein),采用RT-PCR方法从吕氏泰勒虫裂殖子总RNA反转录获得TlSP基因的c DNA序列,将其多态性免疫区域克隆至毕赤酵母表达载体p PIC9K,构建重组质粒p PIC9K-TlSP。p PIC9K-TlSP经SalⅠ酶切线性化后,电转化导入毕赤酵母菌株GS115和KM71中,经遗传霉素G-418筛选后得到高拷贝菌株,对PCR鉴定为阳性的菌株进行甲醇诱导表达。对GS115和KM71两种菌株表达重组蛋白TlSP的效果进行评估,并对TlSP的反应原性进行了分析。结果表明,反转录获得的TlSP基因的c DNA序列长为888 bp,其中多态性免疫区域长为552 bp;筛选得到抗遗传霉素G-418(4.0 mg/m L)的GS115菌株5株,KM71菌株7株,经PCR鉴定为阳性的2种菌株均成功表达了分泌型重组蛋白TlSP,GS115菌株的蛋白表达效果较好;重组蛋白TlSP能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、绵羊无浆体阳性血清无反应。本研究为深入研究TlSP蛋白在羊泰勒虫病免疫学诊断和亚单位疫苗中的应用奠定了基础。     

芽胞杆菌的分离鉴定

为了确定实验室筛选的6株芽胞杆菌(Bacillus spp.)的种名,利用形态学、DNA促旋酶A亚单位基因(DNA Gyrase Subunit A,gyr A)和DNA促旋酶B亚单位基因(DNA Gyrase Subunit B,gyr B)序列的单基因系统发育分析和PCR相结合的方法进行鉴定。结果表明,6株芽胞杆菌的单菌落生长特征相似,革兰染色呈阳性,具有芽胞;以gyr A和gyr B基因构建的单基因系统发育树显示6株菌均与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)归于同一分支,自展值(Bootstrap)较高;特异性PCR结果也证实它们均为贝莱斯芽胞杆菌阳性。结论,实验室分离的6株芽胞杆菌均属于贝莱斯芽胞杆菌,这为它们的深入研究奠定了基础。     

环形泰勒虫TaSDP基因的原核表达及TaSDP蛋白多克隆抗体的制备

利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增TaSDP(Theileria annulata schizont-derived protein)基因,用获得的基因片段构建原核表达载体pET-30a(+)-TaSDP,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,蛋白以包涵体的形式存在;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并分别用ELISA和Western-blot测定抗体的效价及特异性。结果显示,获得的TaSDP基因的长度为552bp,制备的多克隆抗体不仅可与重组蛋白His-TaSDP发生反应,而且可以识别天然的虫体蛋白,效价高于1∶215。上述研究结果为开展TaSDP在细胞调控方面的研究奠定了基础。