细胞凋亡检测技术的研究进展

细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的细胞死亡方式 ,是在一定的生理或病理情况下 ,机体为维护内环境的稳定 ,通过基因调控 ,激活内源性核酸内切酶而发生的细胞自动消亡的过程 ,亦称为程序化细胞死亡 (programmedcelldeath ,PCD) [1 ] 。自 1 972年Kerr等[2 ] 根据细胞发生了与坏死完全不一样的死亡过程而提出细胞凋亡 (apoptosis)的概念后 ,引起细胞生物工作者的注意 ,但由于当时检测技术的限制 ,这种细胞凋亡现象只停留于形态描述 ,缺乏定性、定量、定位的依据 ,并未引起病理工作者的重视。 2 0世纪 80年代末 ,随着分子生物学、细胞生物学等…     

鸭肿头出血症病毒在鸭胚原代成纤维细胞中增殖特性的研究

将鸭肿头出血症病毒(DSHDV)强毒株经尿囊腔接种10日龄鸭胚,传3代,取第3代尿囊液接种鸭胚成纤维细胞(DEF),传代培养至有细胞病变出现,并对接毒细胞进行TCID50动态检测和透射电镜观察。结果显示,第1代接毒细胞培养至120 h出现变圆、脱落,并形成少量蚀斑,第2代培养至96~120 h,DEF形成大量圆形或椭圆形的典型蚀斑,第3代培养至72~96 h,DEF出现典型蚀斑;此后可稳定适应于DEF,典型细胞病变出现于72~96 h。DSHDV在DEF上的TCID50值随传代次数的增加而增高,由第1代的102.75增加到第10代的106.82,最高毒价出现于96 h,该点是收获病毒的最佳时间。经透射电镜观察,可见DSHDV粒子呈球形或椭圆形,大小为60~75 nm,无囊膜,具有双层衣壳。结果证实,DSHDV强毒株已经适应了DEF,传代后可获得较高的病毒效价。     

人工感染仔猪猪生殖与呼吸综合征病毒的核酸分布规律

根据猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株ATCC VR-2332保守区ORF6和ORF7的基因序列,设计了1条37 bp的寡核苷酸探针,末端用生物素标记.应用原位杂交方法对人工感染PRRSV SC-1株的28日龄仔猪进行了病毒核酸分布规律的研究.结果显示,感染后7～28 d于肝、脾、肺、肾、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、肠和大脑检测到阳性杂交信号,其中肺门淋巴结的阳性信号一直较强,脾的阳性信号逐渐增强,肺的阳性信号较弱,心脏未见阳性杂交信号.     

抗鹅细小病毒卵黄IgG的制备及其间接ELISA检测方法的建立

采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提与DEAE50纤维素层析相结合的方法从免疫鹅细小病毒(GPV)的鹅卵内提取鹅卵黄IgG,通过核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG的浓度和纯度后,制备兔抗鹅IgG酶标抗体;建立了针对GPV的间接ELISA抗体检测方法,确定其最佳工作条件,并对该ELISA的特异性及重复性进行检测;应用该间接ELISA检测了GPV VP3基因疫苗的免疫效果。结果显示,获得的纯化鹅卵黄IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度达到94.5%,兔抗鹅IgG的血清琼脂扩散效价约为1∶32;经筛选确定该ELISA的最佳工作条件为:最适抗原包被浓度为20μg/mL,最适血清稀释度为1∶100,酶标抗体的最佳工作浓度为1∶3 000。用建立的间接ELISA检测禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒的阳性血清均为阴性,表明该方法特异性强、重复性好。经临床初步应用,能检出GPV VP3基因疫苗产生的抗体,在肌肉注射100μg与200μg基因疫苗的鹅血清中,IgG均从第14天开始上升,并分别在第35、21天达到最大值。表明本试验制备的兔抗鹅IgG酶标抗体具有较好的应用价值。     

雏鹅新型病毒性肠炎病毒弱毒株的培育及其特性研究

应用在鸭胚成纤维细胞上连续传代的方法 ,获得了由雏鹅新型病毒性肠炎病毒强毒株(NGVEV CN株 )致弱的弱毒株 (CN4 0 株 )。该弱毒株TCID50 为 10 - 8.0 83,具有良好的安全性和稳定性 ,在易感 1日龄雏鹅连传 8代不返强。该弱毒具有良好的免疫原性 ,最小免疫剂量为 10 0 0 0TCID50 ,免疫后 3d产生部分免疫力 ,5d产生坚强免疫力。口服免疫效果最好 ,对雏鹅免疫期在30d以上。该弱毒株能够干扰强毒在雏鹅体内繁殖 ,进入鹅体后能够进行一定程度繁殖并排泄出体外 ,使同居雏鹅感染并获得一定程度免疫力。临床使用后可极显著降低雏鹅的死亡率。     

鸡减蛋综合征的研究──SG_（9301）毒株的分离鉴定及病原特性

鸡减蛋综合征的研究──ＳＧ_（９３０１）毒株的分离鉴定及病原特性程安春，汪铭书，廖德惠，陈孝跃（四川农业大学动物科技学院雅安６２５０１４）自从ＶａｎＥｃｋ于１９７６年首次报道鸡减蛋综合征（ＥＤＳ_（７６）至今，世界上很多国家相继发生了该病。我国１９８６...     

鸭瘟病毒UL26.5基因的克隆和编码蛋白的亚细胞定位

对鸭瘟病毒(DPV)UL26.5基因(GenBank登录号EF643564)的分子特征分析表明,其具有疱疹病毒支架蛋白的典型特征,含有6个保守的结构功能域和1个丝氨酸蛋白酶水解位点(M位点),且具有与其功能相关的磷酸化位点;编码的多肽链是一种膜外蛋白.DPV UL26.5与α-亚科禽类疱疹病毒属的进化关系最近.将UL26.5基因扩增产物亚克隆至pET-32a(+)原核表达载体,并转化至E. coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得一约59 ku的表达蛋白,与预期大小一致.将重组蛋白纯化后,制备兔抗血清,经间接ELISA检测,效价达1:204 800.DPV UL26.5基因编码蛋白亚细胞定位检测结果显示,最早可在感染后10 h的细胞核中检测到该蛋白,12 h后细胞核中出现较多绿色荧光,48 h时细胞质中也出现少量荧光.试验结果为进一步开展DPV UL26.5基因功能的研究提供了重要数据和材料.     

介导鸭疫里默氏杆菌耐β-内酰胺类药物发生的研究

采用平板二倍稀释法检测了临床分离的54株耐β-内酰胺类药的鸭疫里默氏杆菌(RA)的最低抑菌浓度(MIC值),进一步开展了耐药泵表型检测、β-内酰胺酶表型和基因型检测以及脉冲电泳指纹图谱和耐药泵相关性研究.结果显示,54株RA临床分离株对苯唑西林、青霉素、头孢噻肟和头孢吡肟的耐药率分别为100%、100%、66.7%和98.15%;耐药泵抑制剂氰氯苯腙可使53株RA对β-内酰胺类药物MIC值显著下降(P＜0.01),MIC下降倍数最高达到2048倍,耐药率依次下降为88.89%、46.30%、22.22%和38.89%;54株RA的β-内酰胺酶表型和基因型检测结果均为阴性;54株RA基因组经Sma Ⅰ酶切后以82%相似性系数为界,可分为13个脉冲电泳群,同一群的不同菌株可以认为是同一菌株不同克隆亚体或突变体.Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅶ群、Ⅷ群、Ⅺ群和Ⅻ群对头孢吡肟和V群对头孢噻肟的耐药是由耐药泵介导的,而其他群的菌株则出现了其他机制.说明,耐药泵只是介导RA对β-内酰胺类药物耐药的主要因素之一.     

鸭瘟病毒gB基因B细胞和T细胞表位的预测及其主要抗原域基因的原核表达

应用生物信息学工具对本实验室鉴定的鸭瘟病毒(DPV)CHv毒株gB基因(GenBank登录号:EF608147)编码蛋白进行了B、T细胞表位预测,对其主要抗原域基因进行了PCR扩增,构建了原核表达载体pET-28a-gBM,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.结果表明,重组菌可表达分子质量约46 ku的重组融合蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的30%.Western-blot分析显示,表达蛋白能够被兔抗DPV多克隆血清特异识别,证实该氨基酸片段具有较强的免疫原性.