重组鸡IFN-α的高效表达与一步复性和纯化

通过在线网站以及生物学软件分析,将天然鸡IFN-α基因中的稀有密码子同义替换为大肠杆菌偏好的密码子.优化后的基因经人工合成后与温控型表达载体pWL连接并转入大肠杆菌中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达产物的分子质量约为19 ku,表达量占总蛋白的28.3%.表达产物主要以包涵体形式存在,用高浓度变性剂溶解后,采用Sephadex G50凝胶过滤一步复性并纯化重组鸡IFN-α,纯度可达98%以上.每1 L培养基可以得到47.1 mg的重组鸡IFN-α,产出率达34.14%.表达的重组鸡IFN-α在CEF/NDV检测系统上的比活性为1.12×10~8U/mg.     

禽流感病毒M1抗体间接阻断ELISA检测方法的建立

以禽流感病毒(AIV)重组M1蛋白作为检测抗原,兔抗M1血清为阻断抗体.建立了检测AIVM1抗体的间接阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原最佳包被浓度为0.78 μg/mL,阻断抗体最佳稀释度为1:15 000,待检血清最佳稀释度为1:10.用该ELISA方法对38份AIV阳性禽类样本和26份A1V阴性禽类样本进行检测,结果显示.该方法的敏感性为97.37%,特异性为96.15%.交叉试验证明该方法与新城疫等8种其他禽病阳性血清不发生交叉反应.用该ELISA方法对268份已知HI效价的临床样品进行检测,结果与HI的符合率达92%以上.表明,建立的间接阻断ELISA方法可用于AIV抗体的检测和禽流感的流行病学调查.     

1型鸭肝炎病毒E53株和HP-1株全基因组序列分析

根据已发表的1型鸭肝炎病毒(DHV-1)基因组序列设计并合成引物,通过RT-PCR方法对DHV-1 E53株和HP-1株的基因组序列进行分段扩增并测序.BLAST分析确定为DHV-1型基因组序列,GenBank登录号分别为EF151313和EF151312.E53株与已发表的参考毒株的核苷酸同源性为94.6%～99.4%;HP-1株与已发表的参考毒株的核苷酸同源性为94.4%～99.6%.系统进化树分析结果表明,E53株与北京BJ株进化关系最近;HP-1株与R85952株进化关系最近.     

鹅IFN-α基因的高效表达

通过对鹅IFN-α成熟蛋白基因的分析,利用在线软件,将序列中稀有密码子改为优势密码子,优化了密码子适应性指数,更多地采用了利于表达的密码子对,优化了表达的起始区域和终止区域mRNA的二级结构及自由能.然后,将人工合成的鹅IFN-α基因与表达载体pWL连接后诱导表达.SDS-PAGE分析表明,所表达蛋白的分子质量为18.83 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的35.3%.表达产物以包涵体形式存在.复性、纯化后的鹅IFN-α重组蛋白的纯度达98%,活性达1.28×107U/mL.     

茨城病毒VP7蛋白基因的克隆表达及间接ELISA方法的建立

采用RT-PCR方法扩增出了茨城病毒(IBAV)No.2株编码VP7蛋白的S7全长基因,并克隆入原核表达载体pET-28a( )中,在E.coliBL21中表达。经Western-blot检测,表达的重组VP7蛋白具有良好的反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立了检测IBAV血清抗体的间接ELISA方法。     

牛病毒性腹泻病毒生物型转化分子机制的研究进展

从病毒基因与宿主细胞基因的重组、病毒基因的复制与重排、病毒基因的重复复制和序列插入、病毒基因的缺失和点突变几个方面阐述了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)由非致细胞病变型(NCP)向致细胞病变型(CP)转化的分子变异机制。总结了前人对NCP型向CP型BVDV转化研究的结果,归纳了5种生物型转化形式,揭示了BVDV具有高变异性。     

鹅副黏病毒NP蛋白间接ELISA检测方法的建立及免疫鹅抗体水平的检测

以纯化的鹅副黏病毒NP蛋白为包被抗原,建立了检测鹅副黏病毒NP蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件:抗原包被浓度为1.0μg/mL,血清稀释度为1∶200,兔抗鹅IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶2 000,抗原和血清、血清和二抗均于37℃反应1 h,底物于37℃显色15 min。此间接ELISA方法的特异性强、重复性好。应用该方法对试验鹅血清进行检测,以HI试验为参照。经统计学处理后,比较了两方法测得的抗体效价,分别建立了各组鹅群的回归方程。显著性检验证明,这两种方法检测的抗体效价呈显著相关关系。     

牛化脓隐秘杆菌的分离及其主要毒力基因的PCR鉴定

从2009-2012年多个奶牛场送检的5份以奶牛化脓性炎症为特征的病料中分离出5株细菌,根据其革兰氏染色的形态特征、培养特性、生化特性以及16SrRNA基因序列的BLAST分析,确定分离菌为化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes),并对分离菌的主要毒力因子基因进行了PCR鉴定和动物试验。结果显示,5株分离菌的16SrRNA基因序列与GenBank中收录的11株牛源化脓隐秘杆菌16SrRNA基因序列的同源性为99%以上。HLJ-1005株分离菌基因组中缺失胶原结合蛋白(CbpA)基因,但包含溶血素(PLO)基因、神经氨酸酶H(NanH)基因和神经氨酸酶P(NanP)基因,且HLJ-1005株分离菌的致病力明显弱于其他4株分离菌。证实,化脓隐秘杆菌的致病力与cbpA基因和nanP基因的存在相关。     

内含肽和麦芽糖结合蛋白介导具有抗病毒活性牛α干扰素的表达

为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的重组牛α干扰素(BoIFN-α)蛋白,在BoIFN-α基因的上游无缝连接内含肽Ssp DnaB intein(SDI)序列,然后克隆至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的表达载体pMAL-SDI-BoIFN-α,将重组载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达。结果表明,融合基因获得高效表达,且产物主要以可溶形式存在。经直链淀粉树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经MDBK-BVDV(牛病毒性腹泻病毒)干扰素活性系统检测,证实干扰素融合蛋白具有抗病毒活性。     

抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用已构建好的pET-30a重组菌E.coli Rosetta(DE3)表达鹅细小病毒(GPV)VP3重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后作为免疫原,经腹膜腔接种4～6周龄BALB/c小鼠3次,末次免疫后第3d取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用建立的间接ELISA方法进行筛选,经4次亚克隆,最终获得4株能稳定分泌抗GPVVP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F1、2A9、3B11和4A2。亚类鉴定结果显示,单抗1F1为IgG2b亚型,其余3株单抗为IgG1亚型,轻链均为κ链。经间接ELISA检测,单抗1F1、2A9、3B11和4A2的腹水效价分别为1:819200、1:1638400、1:409600和1:819200。Western-blot分析表明,获得的4株单克隆抗体均能特异性识别GPVVP3重组蛋白;间接免疫荧光试验证明,这4株单抗能够与天然GPV结合。