PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

大熊猫GM-CSF基因的克隆与分析及GM-CSF生物学活性的检测

用含刀豆蛋白的营养液培养大熊猫外周血中分离的淋巴细胞,72h后抽提RNA。设计1对引物,通过RT-PCR方法对大熊猫GM-CSF基因片段进行扩增。测序后对其进行分析,并将该序列克隆到pCI-neo真核载体中,命名为pCI-G,然后免疫健康小鼠,同时设立pCI-neo载体和PBS免疫组为对照。序列分析结果显示,该基因片段含一个完整的开放性阅读框,编码144个氨基酸,与其他几个物种同源性为76.1%～86.2%,预测蛋白中含较多的α-螺旋区域,主要集中在3个区域。免疫结果显示,与对照组相比,pCI-G能够引起小鼠体内IL-4和IFN-γ持续快速的增长,在首免后第56天,二者的质量浓度可达到70.86pg/mL±4.22pg/mL和237.39pg/mL±3.17pg/mL。该质粒可增强小鼠Th2型和Th1型免疫应答,是极具应用潜力的细胞因子。     

猪伪狂犬病病毒SL株gK基因的生物信息学分析

对猪伪狂犬病病毒(PRV)四川分离株(SL株)gK基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对gK基因进行了同源性、遗传进化树、密码子偏向性、蛋白质二级结构预测及抗原表位分析。结果显示,成功克隆了PRVSL株gK全基因,其编码区长939bp,编码313个氨基酸残基,与其他PRV分离株核苷酸序列同源性为97.6%～99.9%,与国外分离株的同源性略高于国内分离株。gK基因存在4个跨膜区及1个明显的CpG岛。表明成功克隆了PRVSL株gK基因,该基因具有潜在的抗原性。     

伪狂犬病病毒主要毒力基因对其致细胞病变能力的影响

以伪狂犬病病毒(PRV)Fa株为对照,时PRV Fa株TK基因缺失株、PRV Fa株gI/gE双基因缺失株和PRV Fa株TK/gI/gE三基因缺失株进行了细胞培养特性的观察.包括对照毒株在内的4个毒株均按0.5 mL(1×10~6PFU)接种量分别感染IBRS-2、Marc-145、ST、Vero和MDBK等细胞系;选择在接种后第0、8、12、24、36和48 h观察感染细胞的形态学变化.结果显示,这4个毒株在这5种细胞上均能增殖并引起细胞病变,但PRV基因缺失株引起的病变程度均不及Fa株.表明,PRV的不同毒力基因对其致细胞病变能力不同.     

内江猪IL-15基因的表达与免疫增强作用研究

参照GenBank中猪IL-15基因的mRNA序列设计1对特异性引物,从经由刀豆蛋白A诱导培养的内江猪外周血淋巴细胞扩增猪IL-15基因;构建其成熟肽原核表达载体pMAL-pIL-15,在Rosetta(DE3)pLysS中表达;构建其真核表达载体pCI-pIL-15,与pCI-gD(PRV)联合免疫雌性BALB/c小鼠以研究其免疫增强作用.测序结果显示,内江猪IL-15基因与发表的猪IL-15基因的核苷酸同源性为97%～99%,含489 bp的完整开放阅读框.SDS-PAGE分析显示,表达的融合蛋白约为52.5 ku,约占菌体总蛋白的27%.Western-blot检测显示,所表达的融合蛋白为麦芽糖结合蛋白的融合蛋白.MTT法试验证实,该融合表达产物经初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞增殖;小鼠免疫试验显示,pCI-pIL～15能够促进小鼠脾CD4+、CD8+T细胞增殖,加强PRV-gD基因疫苗特异性中和抗体的产生.