残缘璃眼蜱subolesin基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

为研究残缘璃眼蜱subolesin基因的生物学特性以及寻找新的抗蜱和蜱传病疫苗候选抗原,根据GenBank上登录的小亚璃眼蜱subolesin基因核苷酸序列设计特异性引物,以残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱的饥饿成蜱cDNA为模板,扩增出subolesin基因的完整阅读框(ORF)。将残缘璃眼蜱subolesin基因的PCR产物经EcoRⅠ+NotⅠ双酶切后连接至表达载体pGEX-4T-1,把重组质粒pGEX-4T-1-subolesin导入感受态细胞BL21(DE3)中,在37℃、1mmol/L IPTG条件下诱导表达。利用SDS-PAGE分析subolesin基因的体外表达特征;用Western-blot分析Subolesin蛋白的反应原性。结果显示,残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱subolesin基因的ORF长度分别为492、492、486bp,分别编码163、163、161个氨基酸。subolesin基因序列和推导的氨基酸序列的比对结果显示,残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱与参考的小亚璃眼蜱的核苷酸序列同源性分别为98%、98%、89%,氨基酸序列同源性分别为98%、99%、93%。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,重组残缘璃眼蜱Subolesin蛋白的分子质量为45ku,纯化的subolesin重组抗原可与抗残缘璃眼蜱全蜱血清、残缘璃眼蜱唾液腺、卵巢血清有较强的反应原性。     

尤氏泰勒虫OPRT基因的优化表达

为克隆和表达尤氏泰勒虫OPRT基因的功能区片段,并对重组OPRT蛋白的反应原性进行分析,以反转录得到的尤氏泰勒虫cDNA链为模板,PCR扩增出OPRT基因片段,然后将其克隆至pET-30a(+)载体;把构建成功的重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21进行优化表达,对诱导表达的蛋白纯化后用Western-blot分析它与吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫阳性血清是否发生交叉反应。结果显示,OPRT基因获得了不可溶性表达,最佳表达时间为6h,最佳表达温度为28℃,且表达的重组OPRT蛋白分别与上述2种泰勒虫阳性血清发生交叉反应。结果表明,OPRT同源基因也存在于吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫之中。     

七种药物对微小牛蜱的半数致死浓度测定

用浸渍法测定了楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、哒嗪酮、螨净 7种药物对未吸血的微小牛蜱 (Boophilusmicroplus)幼蜱、若蜱、成蜱及其饱血雌蜱的半数致死浓度(LC50 )。结果显示 ,所用药物中半数致死浓度最低的 3种药物是楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤。植物性杀虫剂楝素对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为3.0 1～ 3.13、4 .37～ 4 .77、11.18～ 11.36、2 75 .5 0～ 2 76 .5 0mg/L ;植物性杀虫剂苦皮藤对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 4 .2 2～ 4 .4 2、10 .30～ 10 .5 0、82 .5 0～82 .70、6 35 .30～ 6 36 .70mg/L ;人工合成的除虫菊酯类的三氟氯氰菊酯对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 3.4 2～ 3.4 4、7.10～ 9.0 6、4 2 .30～ 4 2 .5 0、5 45 .5 0～5 46 .70mg/L。     

牛羊蜱传性血液原虫超微结构研究——大巴贝斯虫的超微结构观察

电镜观察显示，人工感染大巴贝斯虫的黄牛红细胞有一层绒毛外衣。虫体有双梨子形、单梨子形和形状多变的滋养体。细胞质内有前、后极地环及微丝体、棒状体、线粒体和内质网。除核外还观察到一个球形体。典型的双梨子虫体可见有双生的子细胞在末端相连，维持一段时间后分离，形成单梨子形虫体。滋养体的形态是多变的。大巴贝斯虫红内期的超微结构与双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫相似。     

莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫在我国的分离及形态学观察

在甘肃省庆阳地区的发病及病愈的小尾寒羊血液中分离出２种巴贝斯虫并进行了形态学观察，初步证实该地区“坏肠子”病的病原为巴贝斯虫，一种小型虫体鉴定为羊巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａｏｖｉｓ）。另一种为大型虫体，鉴定为莫氏巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａｍｏｔａｓｉ）。含羊巴贝斯虫的血液注射给除脾羊后，第１４ｄ血涂片中红细胞的染虫率达最高点（为０．５％），之后逐渐下降，感染羊自然耐过。含有混合虫种的血液注射给易感除脾羊后，红细胞染虫率迅速上升至３０．０％，感染后第６ｄ羊因巴贝斯虫病死亡。对２种虫体做了量度和形态学描述，并与欧洲的相同虫种作了比较。     

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因高免疫原性区片段的克隆及其表达

根据环形泰勒虫TaA12 72 1株裂殖体表面抗原 (TaSP)基因的序列设计了 1对引物 ,用PCR扩增出该基因长为 393bp的高免疫原性区片段 (SBxp)。将扩增产物连接到 pGEM TEasy载体上 ,转化入大肠埃希氏菌JM 10 9中进行克隆。随后将重组质粒 pGEM SBxp和表达载体 pGEX 4T 1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后 ,将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体 pGEX 4T 1 SBxp ,并将其转化到BL2 1宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后 ,阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳和Westernblotting检测。结果 ,SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 4 3ku的融合蛋白 ,该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。     

山羊边虫病的研究——西北地区羊边虫的分布

笔者利用补体结合试验和病原检查相结合的方法,首次在陕西、甘肃、宁夏、青海四省(区)23个县发现绵羊边虫。经实验证实,血清学检疫的最佳季节应在媒介蜱大量侵袭后1个月左右进行为宜。可疑带虫羊的脾切除后,可使虫体大量繁殖,在检疫地区以优势种蜱感染健康除脾羊可揭示边虫存在与否,这两种方法均可作为检疫的补充方法应用。     

补体结合试验诊断边虫感染牛的研究

利用边缘边虫DS-1株接种除脾易感牛,制备出补反诊断抗原。所制备的抗原具有良好的特异性和敏感性,并建立了总量为0.6ml的补反诊断方法。对试验条件下人工感染牛的补反检出率为100％,安全区无假阳性反应。人工感染牛第5天出现补反抗体,感染后20～50天血清抗体达到高峰,以后开始下降,7个月后补反抗体消失。所制备的补反抗原与双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、大巴贝西虫,环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、伊氏锥虫和日本血吸虫等几种血液寄生虫抗血清之间没有交叉反应。抗原保存期达一年以上。所制备的抗原达到了国外同类产品的水平。     

微量补体结合试验诊断边虫感染牛的研究

利用边缘边虫DS—1株接种除脾易感牛,制备出补体结合试验诊断抗原,并建立了边虫感染牛总量为0.2ml的微量补反诊断法。所制备的抗原具有良好的特异性和敏感性,对实验室条件下人工感染牛的补反检查,符合率为100％;自然条件下感染牛补反检查的符合率为92.3％;安全区牛无假阳性反应。人工感染牛于第10天可测出补反抗体,30～40天抗体滴度达到高峰,60天后开始下降。边虫补反抗原与瑟氏泰勒虫、双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、伊氏锥虫、肝片吸虫、日本裂体吸虫感染牛血清无交叉反应,与正常红细胞免疫牛血清反应为阴性结果。