O型FMDV VP1基因的真核表达及其产物的生物学活性

根据已克隆的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计了1对带有SacⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用其将pMD18-T-VP1质粒中的VP1基因亚克隆到真核表达载体pBlueBacHis2A中,成功地构建了重组表达质粒pBlueBacHis2A-VP1(633bp)。将pBlueBacHis2A-VP1(633 bp)质粒与Bac-N-BlueTMDNA共转染sf9昆虫细胞,蚀斑筛选重组病毒后,将纯化的重组病毒感染sf9细胞,获得了32.6 ku的目的蛋白条带。Dot-ELISA分析结果表明,该表达产物具有反应活性,可用于建立间接ELISA方法,进行口蹄疫病毒抗体检测。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出A群猪轮状病毒(PRV)G5型OSU株长度约为1.0kb的基因片段,将其克隆到pMD 18-T载体上进行测序鉴定,证明为该PRV的VP7蛋白基因,与已发表的该PRV VP7基因序列的同源性为99.8%.将该基因黏端克隆至表达载体PblueBAChisC质粒中,酶切及PCR鉴定表明获得了PRV-VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子.纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5 d后收获重组病毒.通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定,确定PRV-VP7基因已正确插入.将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后,获得了重组杆状病毒PRV-VP7蛋白的真核表达.     

鹅细小病毒VP2基因原核及真核表达载体的构建

将鹅细小病毒VP2基因克隆到原核表达载体 pPROEX HTb及真核转移载体pFASTBAC HTb中 ,重组真核转移载体在DH10BAC 中经转座作用 ,成功构建了表达VP2基因的原核表达载体pPROEX HTb VP2和杆状病毒表达载体BAC VP2。经限制性内切酶酶切及PCR分析 ,确定为阳性重组子     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

重组鹅IFN-α蛋白在内含肽-冷激诱导表达系统中的表达

为了在大肠杆菌系统中高效表达具有抗病毒活性的重组鹅IFN-α(GoIFN-α)蛋白,在GoIFN-α基因上游融合内含肽Ssp Dnabmini-intein(SDI)序列,然后克隆至pET-43.1a(+)载体中,再将获得的pET-43.1a(+)-SDI-GoIFN-α重组载体和pColdⅢ载体分别进行双酶切,构建内含肽-冷激表达载体pColdⅢ-Nu-sA-SDI-GoIFN-α,将重组载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞,IPTG低温诱导表达。结果表明,融合基因获得高效表达,表达的融合蛋白主要以可溶形式存在。表达产物经Ni柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经CGBQ-GPMV系统检测,证实表达的融合蛋白具有生物学活性,为后续的纯化工作和研究具有天然活性的重组鹅IFN-α奠定了基础。     

牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定

为进一步研究牛IFN-γ(BoIFN-γ)单克隆抗体在牛免疫学以及牛疫病诊断中的应用,用原核表达的重组牛IFN-γ(rHis-BoIFN-γ)免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,免疫3次后取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经3～5次亚克隆,最终获得12株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株。Ig亚类鉴定结果显示这12株杂交瘤细胞均为IgG,其中5株为IgG1,3株为IgG2a,4株为IgG2b。这12株杂交瘤细胞在体外具有稳定分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的能力。Western-blot及间接ELISA证明这12株单克隆抗体均可特异性地结合rBoIFN-γ蛋白。间接免疫荧光试验显示,这12株单抗均与真核细胞BHK-21表达的rBoIFN-γ产生荧光反应,证明这些单抗能够与接近天然的BoIFN-γ反应,证实了单抗的特异性。ELISA叠加试验表明,3C2与1H4、1G6与1G4针对不同表位,1A10、1B2、2B9、3C4四株和1C1与1G6、1G4与3C2、1A10与1G8针对相同或相近的表位。