金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖偶联抗原的制备及免疫原性分析

为建立金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)纯化与偶联技术方法,获得具有免疫原性的CP5偶联抗原,采用高压破碎菌体的方法释放荚膜多糖,酶处理去除核酸和蛋白质,通过离子交换层析进一步纯化,得到纯化的CP5,并对其纯度和反应原性进行检测;采用己二酸二酰肼(ADH)间桥法制备CP5-牛血清白蛋白(CP5-BSA)偶联抗原,加佐剂免疫小鼠,进行抗体水平测定。结果表明,纯化的CP5纯度为675.1g/kg,经用免疫琼脂双扩散试验检测,纯化多糖仅与同型菌株抗血清发生沉淀反应,偶联抗原CP5-BSA可以刺激小鼠产生CP5免疫应答。此研究结果为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的研制提供了试验依据。     

头孢噻呋钠-壳聚糖纳米粒的制备及相关性质的研究

为了延长头孢噻呋钠的作用时间,采用离子交联法制备头孢噻呋钠-壳聚糖纳米粒,研究其形态、粒径、载药量、包封率和体外释药特性。结果显示,经优化工艺所得的纳米粒形态规整,近圆形,平均粒径为179.4±39.5nm,平均包封率为84.31%±2.53%,平均载药量为6.69%±0.18%。体外释放试验表明,原料药在放入释放介质后第4小时释放率达到90%以上,而纳米粒在此时药物仅释放60%。结果表明,该纳米粒制备工艺可行,对头孢噻呋钠具有明显的缓释效果。     

广西奶牛隐孢子虫病的流行病学调查

为了调查广西奶牛隐孢子虫病的流行情况,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对广西9个奶牛场和4个奶牛个体养殖户的1 612头份粪样进行隐孢子虫卵囊的检测,并以基于18SrRNA基因的PCR-RFLP技术对分离的隐孢子虫卵囊进行种类鉴定。结果显示,7个奶牛场发现存在隐孢子虫感染,隐孢子虫阳性粪样为189头份,总感染率为11.72%(189/1 612)。在感染的年龄段上,1～6月龄犊牛的隐孢子虫感染率为21.3%,显著高于7～12月龄的青年牛(9.6%)和大于1岁龄的成年牛(3.8%)(P<0.01)。感染季节以冬季感染较高,但与夏季感染结果相比差异不显著(P>0.05)。PCR-RFLP分析显示,分离的7个隐孢子虫株均为安氏隐孢子虫。调查表明,广西奶牛隐孢子虫虫株以安氏隐孢子虫为主,感染率与河南、江苏、安徽、吉林等省份相似。     

重复热应激致公兔性腺氧化损伤的研究

为探讨热应激对雄性兔性腺的氧化损伤机制,以体重相近的110日龄雄性新西兰兔为研究对象,每天在固定时间分别以31～34℃和38～40℃进行热应激,并分别在热应激后的第15、30、45及60天处死兔,取样检测性腺组织内总抗氧化酶活性、丙二醛及蛋白质羰基含量。结果显示,随着温度升高,睾丸和附睾组织丙二醛含量增加,总抗氧化酶活性降低,蛋白质羰基含量呈上升趋势,表现出明显的温度-时间效应。表明高热可改变兔睾丸和附睾的正常生理机能,使自由基在组织内累积,引起蛋白质氧化损伤,进而降低繁殖机能。     

捻转血矛线虫伊维菌素耐药株P-糖蛋白基因多态性的PCR-RFLP分析

为了解P-糖蛋白基因在捻转血矛线虫伊维菌素耐药株和敏感株间的差异,进一步弄清该基因与伊维菌素耐药性产生的关系,用PCR-RFLP方法分析了捻转血矛线虫伊维菌素耐药株P-糖蛋白基因hcpgp-1的多态性,并对所得序列进行测序。结果表明:捻转血矛线虫伊维菌素敏感株虫体的PCR产物不能被内切酶KpnⅠ切开,而伊维菌素耐药株虫体的PCR产物可被内切酶切开;酶切后统计数据显示,10条敏感虫株全部为敏感纯合子(BB);在所检测的20条伊维菌素耐药性虫株中,抗性纯合子(AA)6个(30%),杂合子(AB)13个(65%),敏感性纯合子(BB)1个(5%)。其中,AB基因型频率最大,为优势基因型,其次为AA型,BB型比例最低。抗性等位基因A为优势基因,其频率为62.5%,敏感等位基因B的频率为37.5%。同源性分析发现,具有抗性的糖蛋白基因hcpgp-1与敏感株的同源性较低,在80.2%～89.3%之间。且发现伊维菌素耐药株hcpgp-1基因序列中,有多处碱基发生了突变。本研究结果为进一步了解P-糖蛋白在捻转血矛线虫伊维菌素耐药性产生中的作用,提供了参考数据。     

猪传染性胃肠炎病毒S-N融合双基因疫苗的构建及其免疫原性分析

为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基因的重组质粒pVAX-S-N,将pVAX-S-N转染COS7细胞以免疫荧光试验进行S、N双基因的表达鉴定。用纯化的pVAX-S-N和作为对照的pVAX-S、pVAX1、PBS免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,分别测定免疫后第0、14、28、42天的小鼠血清IgG抗体,测定免疫后第42天小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的数量。结果,融合质粒pVAX-S-N可在COS7细胞特异性表达S、N两个蛋白,pVAX-S-N免疫小鼠后第14天即可诱导产生抗TGEV的特异性IgG,但pVAX-S-N诱导的抗体水平一直低于pVAX-S诱导的抗体水平,在免疫后第42天差异极显著(P<0.01);pVAX-S-N可激发小鼠产生细胞免疫应答,但pVAX-S-N组的CD3+、CD4+、CD8+数量均低于pVAX-S免疫组。研究结果表明,融合双基因疫苗pVAX-S-N具有免疫原性,但免疫效果却不如单基因疫苗pVAX-S的理想。     

Ⅰa型和Ⅱ型牛源无乳链球菌sip基因的遗传进化分析

为分析8株Ⅰa型和10株Ⅱ型牛源无乳链球菌的sip基因特征和遗传进化关系,采用PCR方法扩增目的基因并克隆入pGEM-T Easy载体后测序,进行了同源性分析和构建了遗传进化树。结果显示,18株菌株的sip基因全长均为1 305bp,无基因缺失。8株Ⅰa型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性分别为99.8%～100%和99.5%～100%;而10株Ⅱ型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性均为100%。18株菌株与其他不同来源、不同血清型参考菌株相应序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为97.8%～100%和96.8%～99.8%。sip基因的遗传进化树分析显示18株菌株处于2个不同的大分支上,其中Ⅱ型菌株处于同一分支上,与中国菌株Mf32和美国菌株GB01068、GB01089的亲缘关系最近,而Ⅰa型菌株处于另一个分支上,与中国菌株Ly2和美国菌株GB00549的亲缘关系最近。说明8株Ⅰa型菌株和10株Ⅱ型菌株分别来源于不同的菌株,但它们的sip基因同源性很高,而且与参考菌株的sip基因相比,目前仍属于保守基因。     

减毒沙门菌递呈的猪传染性胃肠炎病毒S基因与猪IL-6基因双启动子DNA疫苗的构建

从猪传染性胃肠炎病毒克隆质粒pMD19T-S中扩增了2.1kb的S基因片段(含完整的A、B、C、D 4个抗原位点序列),以RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增了猪白细胞介素6(IL-6)(658bp),插入同一双启动子真核表达载体pVAXD的2个多克隆位点,构建了共表达S与IL-6基因的双启动子表达质粒pVAXD-S-IL-6,转染COS7细胞进行转录和表达鉴定。将质粒pVAXD-S-IL-6电转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,筛选获得重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6),并对重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)的体外稳定性和口服小鼠的安全性进行了鉴定。结果表明该双启动子真核表达质粒pVAXD-S-IL-6构建成功,RT-PCR检测到转染的COS-7细胞中2个目的基因的转录,间接免疫荧光试验结果显示表达产物可与猪抗猪传染性胃肠炎病毒血清发生特异性反应。重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)在含卡那霉素的抗性培养基中稳定性好,以1×109 CFU灌胃接种小鼠具有良好的安全性。本研究构建了猪传染性胃肠炎病毒的新型口服疫苗株SL7207(pVAXD-S-IL-6),为开展其免疫原性评价奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Myanmar株全基因序列的测定与遗传变异分析

2010年首次从缅甸某发病猪场采集的疑似猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and re-spiratory syndrome,PRRS)病料中分离到一株PRRSV,命名为PRRSV Myanmar株。应用RT-PCR方法分段扩增出Myanmar株的各基因片段,并将扩增产物分别连接到pEASY-T3载体并进行测序。序列测定结果表明,Myanmar株基因组全长15 411bp(不包括PolyA尾),包含10个开放阅读框,5′UTR长189nt,3′UTR长151nt。全基因序列与经典PRRSV VR2332株核苷酸序列的一致性为99.3%,与高致病性PRRSV NVDC-JXA1株核苷酸序列的一致性为89.5%。在非结构蛋白Nsp2区域并未出现特征性的30个氨基酸的缺失,而与欧洲型标准毒株(LV)核苷酸序列的一致性为54.6%。上述结果说明Myanmar株在基因型上属于经典美洲型。同时,遗传进化树分析显示,Myanmar株与PRRSV 01NP1.2株、RespMLV株、BJ-4株及PL97-1株的亲缘关系最近。     

从客观性到相关性：中国证据法学四十年回顾与展望

改革开放四十年来,证据“客观说”长期影响着我国证据法学的发展,不仅造成了我国证据法学理论体系和证据制度的不健全,而且给司法实践带来严重后果。自1996年以来,随着证据“客观说”自身谬误的凸显、疑罪从无原则和证据裁判原则的确立、以审判为中心的刑事诉讼制度改革、英美证据理论在我国的影响力日益增大及证据法学学科建设取得的显著进步,我国证据法学出现了从执迷于证据“客观说”到接受证据相关性规则的转型趋势。为实现彻底转型,应通过立法和指导性案例明确相关性的定义及内涵,指引司法实践和学术研究;以相关性为逻辑主线,构建体系化的证据规则和证据理论。