羊泰勒虫中国株裂殖子的蛋白分析

采用SDSPAGE和Westernblotting试验对羊泰勒虫临潭株、隆德株、张家川株和夏河株裂殖子蛋白进行了分析。SDSPAGE结果显示,羊泰勒虫临潭株与隆德株的亲缘关系较近;张家川株与夏河株的亲缘关系也比较近。4个虫株的阳性血清分别与4个株裂殖子蛋白的Westernblotting试验结果表明,4个株虫体的阳性血清与临潭株和张家川株的裂殖子蛋白在38ku处有共同反应。提示38ku蛋白多肽有望成为特异性诊断抗原,为重组疫苗的研究提供依据。     

微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库的构建

为了研究微小牛蜱功能性抗原基因,从微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱中提取总RNA并分离纯化mRNA。采用Oligo(dT)引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ、HindⅢ定向接头,用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体。经体外包装,成功构建了我国微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库,铺板测定原始库容量为4.5×105PFU,扩增后的滴度为7.2×1010PFU/mL。     

中华泰勒虫MPSP基因的原核表达及反应原性分析

用生物信息学方法,对中华泰勒虫的梨浆虫主要表面蛋白(major piroplasm surface proteins,MPSP)基因的核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列进行了分析,并对该蛋白的抗原表位、信号肽以及跨膜区进行了预测。设计特异性引物,对中华泰勒虫MPSP基因进行了克隆和原核表达,并对融合蛋白的反应原性进行了分析。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白的分子质量约为38ku,分布于上清中。Western-blot试验表明,融合蛋白仅与抗His标签蛋白的单克隆抗体、中华泰勒虫阳性血清、瑟氏泰勒虫阳性血清、环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与其他泰勒虫、巴贝斯虫和绵羊无形体阳性血清不发生反应。这些结果表明,中华泰勒虫MPSP可作为ELISA诊断方法的候选抗原。     

小亚璃眼蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的边缘革蜱4D8基因序列设计1对引物,采用PCR技术自半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺cDNA表达文库中扩增获得了4D8基因;将其连入pMD18-T载体,构建重组克隆载体pMD18-Hyaa4D8.测序分析表明,克隆的小亚璃眼蜱4D8基因与边缘革蜱4D8基因的核苷酸序列的同源性为89.2%.将此片段定向亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Hyaa4D8,表达并纯化重组蛋白,通过免疫印迹试验鉴定该重组蛋白的生物学活性.结果显示,该重组蛋白是分子质量为45ku的融合蛋白,且表达产物能被半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺抗原免疫兔血清识别.     

八种杀蜱药物与球孢白僵菌分生孢子的生物相容性

为探索绿色高效的杀蜱新制剂,采用营养液萌发法和平板生长法测定了8种杀蜱药物与球孢白僵菌分生孢子的生物相容性.结果显示,这8种药物与白僵菌的相客性和药物浓度呈负相关,次亚致死剂量的苦皮藤素、灭幼脲和溴氰菊酯与白僵菌的相容性良好,萌发率均在85%以上;用浸渍法测得白僵菌孢子浓度在1×107/mL时对蜱的致死率可达100%.结果表明,所试验的8种药物中,苦皮藤素、灭幼脲和溴氰菊酯可与白僵菌配伍使用;白僵菌的最佳使用浓度为1×107/mL.     

牛巴贝斯虫体外培养体系的建立

利用静相培养技术,建立了牛巴贝斯虫(Babesia bovis)的体外连续培养体系,测定了虫体的生长特性和对不同种属动物红细胞的侵染性。结果显示,牛巴贝斯虫的生长周期介于33.66～38.51h之间;在体外可入侵牛、人、驴和绵羊的红细胞,难以侵入山羊的红细胞,且只在牛红细胞中实现传代培养。该方法的建立为寄生虫和宿主细胞相互作用的研究、治疗药物的筛选、诊断和疫苗用抗原的鉴定等提供了技术平台。     

吕氏泰勒虫TlSP基因多态性免疫区在毕赤酵母中的高效分泌表达

为研制具有完整抗原性和天然结构的吕氏泰勒虫表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein),采用RT-PCR方法从吕氏泰勒虫裂殖子总RNA反转录获得TlSP基因的c DNA序列,将其多态性免疫区域克隆至毕赤酵母表达载体p PIC9K,构建重组质粒p PIC9K-TlSP。p PIC9K-TlSP经SalⅠ酶切线性化后,电转化导入毕赤酵母菌株GS115和KM71中,经遗传霉素G-418筛选后得到高拷贝菌株,对PCR鉴定为阳性的菌株进行甲醇诱导表达。对GS115和KM71两种菌株表达重组蛋白TlSP的效果进行评估,并对TlSP的反应原性进行了分析。结果表明,反转录获得的TlSP基因的c DNA序列长为888 bp,其中多态性免疫区域长为552 bp;筛选得到抗遗传霉素G-418(4.0 mg/m L)的GS115菌株5株,KM71菌株7株,经PCR鉴定为阳性的2种菌株均成功表达了分泌型重组蛋白TlSP,GS115菌株的蛋白表达效果较好;重组蛋白TlSP能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、绵羊无浆体阳性血清无反应。本研究为深入研究TlSP蛋白在羊泰勒虫病免疫学诊断和亚单位疫苗中的应用奠定了基础。     

顶复门原虫滑动体相关分子的研究进展

对顶复门原虫的运动装置———滑动体的主要组成蛋白分子及其在运动与宿主细胞入侵过程中的分子机制等方面的最新进展进行了综述,旨在总结现阶段顶复门原虫滑动体相关蛋白在其运动和宿主细胞入侵分子机理的最新研究概况,并对该领域研究中存在的主要问题和将来的研究方向进行分析。     

皮蝇Hypodermin C基因的克隆及重组表达载体的构建

参照牛皮蝇HypoderminC(HC)基因的核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,以牛皮蝇总RNA为模板 ,用RT PCR扩增了牛皮蝇HC基因 ,将扩增基因进行克隆测序。测序结果表明 ,所获得基因与已知序列同源性达 99.4 5 %。同时 ,将该基因与表达载体 pGEX 4T 1连接 ,构建并获得阳性重组表达载体。     

环形泰勒虫TaSDP基因的原核表达及TaSDP蛋白多克隆抗体的制备

利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增TaSDP(Theileria annulata schizont-derived protein)基因,用获得的基因片段构建原核表达载体pET-30a(+)-TaSDP,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,蛋白以包涵体的形式存在;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并分别用ELISA和Western-blot测定抗体的效价及特异性。结果显示,获得的TaSDP基因的长度为552bp,制备的多克隆抗体不仅可与重组蛋白His-TaSDP发生反应,而且可以识别天然的虫体蛋白,效价高于1∶215。上述研究结果为开展TaSDP在细胞调控方面的研究奠定了基础。