应用间接免疫荧光法检测新型鸭瘟病毒

采用人工方法给雏鸭和成鸭攻击新型鸭瘟病毒 (NDPV) ,攻毒后于不同时间采样 ,对不同脏器进行间接免疫荧光法检测 ,确定了最佳采样检测时间和病毒在多种脏器内的定位 ,并对其致病力、致病时间、交叉检测结果等与鸭瘟病毒 (DPV)进行了对比。结果表明 ,NDPV对雏鸭致病力较强 ,病毒含量以肝、脾最高 ,其次为血液、脑、鼻腔分泌物 ;NDPV和DPV与它们的对应超免疫血清之间有交叉反应 ,但阳性较弱 ;冰冻切片制成的抗原片阳性检出率明显高于压印片     

鸭瘟病毒抗体间接ELISA检测试剂盒的研制

将鸭瘟病毒(DPV)CHv株经过鸭胚成纤维细胞增殖、反复冻融、差速离心和蔗糖密度介质离心制备纯化抗原,建立了用于检测鸭血清中抗DPV特异性IgG抗体的间接ELISA方法,并对其进行了标准化研究,确定了最佳工作条件,研制了相应的检测试剂盒并对盒内各组分的保存条件、质量控制以及试剂盒的特异性、重复性进行了研究。结果显示,4.75μg/孔的纯化DPV抗原包被反应板可获得良好的特异性和敏感性,1∶100稀释的待检血清样品反应后D405 nm值换算为抗体效价的标准直线方程为y=1.573 3.552x(r=0.953,n=40)。试剂盒在4℃保存3个月或-20℃保存10个月后各项性能都很好。应用该试剂盒对皮下注射、口服和滴鼻免疫DPV弱毒的20日龄樱桃谷鸭血液中抗DPV特异性IgG抗体效价进行了测定,皮下免疫鸭于第6 d,口服和滴鼻免疫鸭于第9 d可在血清中检测到DPV特异性抗体,且至第60 d时依然可检测到高效价抗体。证实,该试剂盒可用于鸭瘟的血清流行病学调查和鸭场免疫抗体水平的监测。     

鸭疫里氏杆菌病灭活疫苗的研制

从河北省某肉鸭场的鸭疫里氏杆菌病发病鸭中分离出鸭疫里氏杆菌 (Riemerellaa natipestifer ,RA)菌株。对该菌株采用液体、固体两种方法增菌培养后制成油乳剂灭活疫苗 ,以 0 .5mL/只剂量经皮下免疫 7日龄雏鸭 ,并在河北省某发病肉鸭场进行了田间试验 ,表明该疫苗免疫效果良好 ,保护率达 90 %以上     

鸭疫里氏杆菌平板凝集抗原的制备

为了对鸭传染性浆膜炎进行快速的型别诊断,探索了不同灭活方法、菌液浓度、染色方法和保存条件对标准1型和2型鸭疫里氏杆菌凝集抗原的影响。结果显示,用甲醛溶液灭活细菌制备的抗原比加热灭活的灵敏度高;石炭酸复红染色液的染色效果优于虎红染色液和草酸铵结晶紫染色液;经石炭酸复红染色液染色的菌液浓度达到109数量级时,常温和4℃保存1年稳定性良好。结果表明,制备的鸭疫里氏杆菌平板凝集抗原可用于临床鸭疫里氏杆菌感染或免疫后抗体的检测。     

抗鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备抗鸭坦布苏病毒(DTMUV)囊膜(E)蛋白的单克隆抗体,将鸭坦布苏病毒E基因进行原核表达,目的蛋白被纯化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,按常规的单克隆抗体的制备技术,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA方法筛选及3次连续克隆化共获得6株能稳定分泌抗E蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,它们分别被命名为1F3、1G2、1B11、2A5、3B6和4F9。Dot-ELISA及Western-blot分析结果表明,这6株单克隆抗体均能与原核表达的E蛋白特异性结合。经间接免疫荧光(IFA)试验验证,这6株单克隆抗体均能识别鸭坦布苏病毒感染的细胞,且荧光主要位于细胞质中。结果表明,本研究成功制备了6株抗鸭坦布苏病毒E蛋白的单克隆抗体。鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备为今后鸭坦布苏病毒快速的病原学诊断以及E蛋白的结构和功能研究奠定了物质基础。     

鸭疫里氏杆菌外膜微孔蛋白基因的克隆和序列分析及PCR检测方法的建立

根据GenBank中的鸭疫里氏杆菌(RA)外膜磷酸盐选择性微孔蛋白(Porin)基因序列设计特异性引物,以血清1、2、6、10、11、13、14和17型RA菌株的基因组DNA为模板均扩增出大小为1 212bp的目的片段,序列比对显示该基因在8种血清型菌株间同源性均大于99.6%。针对保守性最高的357bp片段设计特异性引物,建立了PCR检测方法,对鸭致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、鸭巴氏杆菌及鸭肝炎病毒均未扩增出目的条带,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验显示最小检出量为73.96pg的基因组。应用建立的PCR方法对分离自吉林、河北及北京的8个菌株进行扩增,均在357bp处扩增出清晰的目的条带,与细菌分离鉴定的符合率达100%。本研究为RA的鉴定提供了新方法,为RA外膜微孔蛋白的后续研究提供了理论依据。     

鸭疫里氏杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测鸭疫里氏杆菌,以纯化的兔抗1型鸭疫里氏杆菌抗体作为捕获抗体,以纯化的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。最佳的方案为用184ng/孔纯化的多抗包被过夜,100mL/L小牛血清37℃封闭2h,检测抗原、单抗、酶标抗体均为37℃作用1h,显色20min后终止反应,D450nm值高于0.330且P/N>2.1判定为阳性。该方法特异性强,与禽源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌无交叉反应,最低检测剂量为104 CFU/mL。与传统细菌分离方法相比,该方法的敏感性为100%,符合率为85.2%。本研究首次建立了检测鸭疫里氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法,且特异、敏感。     

鸭瘟病毒gD基因胞外区的原核表达及ELISA检测方法的建立与应用

为研究分离鉴定的鸭瘟病毒gD基因(GenBank登录号:EU195085)及其编码蛋白的应用,采用PCR方法从鸭瘟病毒CHv毒株DNA中获取编码gD胞外区基因729bp片段,构建重组表达载体pET32a-gD,转化受体菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组gD蛋白。结果显示,该重组蛋白分子质量约为31ku,为gD胞外区与载体6个组氨酸的融合表达产物,与gD胞外区预期大小一致(27.5ku);经离心收集菌体,超声裂解后,SDS-PAGE分析结果显示,gD蛋白主要以包涵体形式表达;将包涵体溶解后进行Ni-NTA亲和层析可较好地纯化重组蛋白。Western-blot检测显示,gD蛋白能与兔抗鸭瘟病毒血清特异结合,具有较好的免疫反应性。利用该蛋白建立了ELISA检测方法,优化了该方法的各个反应条件,并进行了初步应用,为该方法的临床应用奠定了基础。     

鸭病毒性肝炎病毒RNA聚合酶在真核细胞中的表达及亚细胞定位

为研究鸭病毒性肝炎病毒RNA依赖性RNA聚合酶的分子生物学特性及其在细胞中的定位,构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒;然后用脂质体介导转染MDCK细胞。分别使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和蛋白免疫电泳试验等方法检测了RNA依赖性RNA聚合酶在细胞中的表达和亚细胞定位情况。结果表明,RNA依赖性RNA聚合酶能与增强型绿色荧光蛋白一起在MDCK细胞中良好表达,且主要分布于细胞核中,Western-blot分析结果显示,融合蛋白在80ku处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性。表明成功构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现RNA依赖性RNA聚合酶主要在细胞核中发挥复制酶的功能。     

鸭疫里氏杆菌敏感烈性噬菌体的分离鉴定

为探索鸭疫里氏杆菌病的生物疗法,以富集法对健康番鸭的粪便进行了分离,获得1株鸭疫里氏杆菌敏感的烈性噬菌体,命名为RAP15.该噬菌体能裂解2株鸭疫里氏杆菌(RAf63和RAf71),说明噬菌谱较窄.透射电镜观察结果显示,该噬菌体由呈多面体的头部(直径约55 nm)和细长的尾部(长约200 nm)组成.RAP15的基因组可以被DNase Ⅰ消化,但不能被RNase A和绿豆核酸酶消化,提示其核酸类型为双股DNA.形态学和分子特征提示,RAP15属于长尾病毒科.