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利用定点突变技术,将A型产气荚膜梭菌α毒素(CPA)第68位组氨酸(CAT)定点突变成甘氨酸(GGT),构建了含CPA突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pMCPA-H68G)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pMCPA-H68G含有CPA-His68Gly突变基因,且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pMCPA-H68G)表达产物经SDS-PAGE分析,其表达量占菌体总蛋白相对含量的31.65%。应用EXPASY服务器上的SOPMA法对CPA和CPA-His68Gly突变体分子进行二级结构的预测,同时模拟了其三级结构。结果显示,CPA和CPA-His68Gly突变体的二级结构主要是由α螺旋和无规则卷曲组成的,三级结构非常相似。 相似文献
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将大肠杆菌DH5α在含胸腺嘧啶核苷和三甲氧苄二氨嘧啶的琼脂平板上培养,获得了遗传稳定的ThyA-大肠杆菌DH5α21株。用PCR扩增野生菌和ThyA-大肠杆菌的thyA基因,将测定的序列与野生型thyA基因相比,6号突变株的thyA基因第92位碱基发生G→A转换,导致第31位甘氨酸被天冬氨酸替换,4、7和13号突变株的thyA基因从第73位连续缺失6个碱基,导致第25位甘氨酸和第26位苏氨酸缺失。经PCR扩增的包括启动子在内的鼠伤寒沙门菌thyA基因与野生型大肠杆菌DH5αthyA基因的同源性为86%。以鼠伤寒沙门菌thyA基因为选择标记,构建了含人溶菌酶基因的真核表达载体pDTALYZ,以ThyA-大肠杆菌为受体菌,构建了染色体-质粒平衡致死系统。在相同条件下,pDTALYZ转化ThyA-大肠杆菌的效率高于以卡那霉素抗性基因为选择标记的pcDNAKLYZ转化野生大肠杆菌的效率;在发酵培养过程中,两种重组菌的生长速率相似,质粒丢失率分别为25%和10%,湿菌重分别为57.68 g/L和51.00g/L,重组质粒产量分别为134.9 mg/L和135.0 mg/L。 相似文献
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采用PCR方法扩增编码产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-plc,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,表达产物经切胶纯化后作为免疫原制备多克隆抗体,应用间接ELISA和Western-blot方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导4~5h后重组蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为66ku。用间接ELISA方法检测的多抗血清效价达到1∶65 536。Western-blot结果证实,重组蛋白与制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的反应原性,而且多抗血清能够检测产气荚膜梭菌分泌的天然α毒素蛋白。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。 相似文献
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为了解新疆部分地区羊源性产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的毒型分布,对疑似病例所采病料进行了菌株分离,用多重PCR方法对菌株进行了毒素分型,用PCR方法对β2毒素基因(cpb2)和肠毒素基因(cpe)进行了检测。结果,在分离的39株菌中,毒素A型占66.67%(26/39),毒素B型占2.56%(1/39),毒素D型占30.77%(12/39);66.67%(26/39)的菌cpb2基因阳性,A、D型菌cpb2基因阳性率分别为42.31%(11/26)和100%(12/12);cpe阳性率为51.28%(20/39),其中A型菌cpe阳性率为50.00%(13/26),D型菌cpe阳性率为58.33%(7/12);cpb2和cpe双阳性菌株占38.46%(15/39)。上述结果为防治新疆羊源性产气荚膜梭菌感染提供了基础资料。 相似文献
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1990年宁夏泾源县暴发了以牛急性死亡为特征的传染病,以后疫区逐年扩大,发病数与死亡数日趋增多。1997年底疫区扩大到10余个县,死亡牛2000多头,同时驴和骡也出现发病、死亡,这种病因不明的“猝死症”已给当地的畜牧业生产造成了较大损失。现已查明,引起以牛为主发生急性死亡的疫病是由产气荚膜梭菌引起的肠毒血症,经用产气荚膜梭菌抗毒素对小白鼠进行中和试验,鉴定出A,C和D型肠毒素。1996年以后,选用产气荚膜梭菌多价疫苗和多联浓缩疫苗对发病地区的牛及马属动物进行兔疫预防,获得较好的效果。 相似文献
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《安徽省人民政府公报》2007,(19):41-41
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