一株铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究

为控制铜绿假单胞菌的感染或污染提供生物制剂,分离到1株新的铜绿假单胞菌噬菌体,并研究其生物学特性。以铜绿假单胞菌为宿主细菌,从山西太谷某养鸡场的污水粪便混合物中分离出噬菌体。采用双层琼脂法对该噬菌体进行了分离和表征鉴定,用透射电镜（TEM）观察噬菌体的形态和大小,同时测定了噬菌体滴度、感染复数（MOI）、体外抑菌活性、一步生长曲线、温度、pH和氯仿稳定性。提取分离的噬菌体DNA,通过测序方法进行序列分析。结果显示,本研究分离出1株铜绿假单胞菌的烈性噬菌体,透射电镜显示该噬菌体属于肌病毒科,命名为v B＿PaeM＿TG2。噬菌斑大小为1～2 mm,最佳MOI为0.1,潜伏期约为10 min,暴发期约为30 min。v B＿PaeM＿TG2对温度、氯仿和pH具有良好的耐受性。v B＿PaeM＿TG2是双链环状DNA,基因组大小为206 910 bp,平均GC含量为62.07%,预测有387个开放阅读框。结果表明,分离的铜绿假单胞菌噬菌体v B＿PaeM＿TG2潜伏期较短,裂解能力强,在高温、高氯仿浓度和宽pH范围下比较稳定。本研究为铜绿假单胞杆菌病的防治提供了新的理论支持。     

消炎祛痘方对痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应抑制作用研究

目的 观察消炎祛痘方对痤疮丙酸杆菌诱导的人急性单核细胞（THP-1细胞）分泌炎症因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、白细胞介素-1α（interleukin-1 alpha,IL-1α）、白细胞介素-8（interleukin-8,IL-8）的影响,探讨其调控痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应机制。方法 采用细胞计数试验盒-8检测消炎祛痘方对THP-1细胞活力的影响;采用ELISA法观察消炎祛痘方对THP-1细胞上清中TNF-α、IL-1α、IL-8水平的影响;采用qRT-PCR和Western blot法分别检测Toll样受体2（Toll like receptor 2,TLR2）及核因子-κB p65（nuclear factor-kappa B p65,NF-κB p65）mRNA和蛋白的表达水平。结果 25 μg/mL消炎祛痘方对THP-1细胞活性无明显影响,12.5、25 μg/mL消炎祛痘方均能抑制痤疮丙酸杆菌诱导的TNF-α、IL-1α、IL-8表达水平,但25 μg/mL消炎祛痘方对3种细胞因子表达的抑制作用更强。12.5、25 μg/mL消炎祛痘方均能抑制TLR2 mRNA的表达,并且两组TLR2 mRNA表达水平的差异无统计学意义。消炎祛痘方能有效降低痤疮丙酸杆菌诱导的TLR2表达水平,25 μg/mL消炎祛痘方降低TLR2的作用更明显。25 μg/mL消炎祛痘方能显著抑制NF-κB p65的表达。结论 消炎祛痘方能抑制痤疮丙酸杆菌诱导的THP-1细胞分泌炎症因子,其机制可能与抑制TLR2/NF-κB信号通路有关。     

健脾补肺化痰方通过调节肠道菌群及其代谢产物组胺治疗小鼠缓解期支气管哮喘

目的 观察健脾补肺化痰方对支气管哮喘缓解期小鼠肠道微生物群的影响。方法 通过卵白蛋白联合Al(OH)3致敏雾化建立缓解期哮喘模型,将模型复制成功的小鼠随机分为模型组、健脾补肺化痰方组、孟鲁司特钠组,每组8只,分别予以生理盐水、健脾补肺化痰方溶液、孟鲁司特钠溶液,另设空白组8只。采用肺通气功能试验检测第1秒用力呼气量/用力肺活量、用力呼气量为25%~75%肺活量时的平均流量/用力肺活量;苏木精—伊红染色观察肺组织与结肠组织的病理变化;夹心酶联免疫吸附试验检测血清、粪便中组胺水平;采用16S rDNA高通量测序对肠道菌群进行检测。结果 与空白组比较,模型组小鼠结肠组织与肺组织存在病理改变,肺通气功能显著下降(P<0.05),血清中组胺水平明显升高(P<0.05),粪便中组胺水平与拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、普氏菌科(Prevotellaceae)群落丰度降低(P<0.05),厚壁菌门(Firmicutes)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)群落丰度明显升高(P<0.05)。与模型组比较,健脾补肺化痰方组结肠组织与肺组织的病变得到缓解,肺功能提高(P<0.05),血清中组胺水平下降(P<0.05),粪便中组胺水平与拟杆菌门、放线菌门、普氏菌科、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)群落丰度升高(P<0.05),厚壁菌门和毛螺菌科群落丰度下降(P<0.05)。拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门与肺功能、组胺水平具有相关性。结论 健脾补肺化痰方可通过调节肠道菌群及其代谢产物组胺治疗缓解期支气管哮喘。     

副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的原核表达与鉴定

为获得副猪嗜血杆菌(HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物,根据GenBank发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成1对特异性引物,以HPS血清13型安徽分离株(LJ3)的基因组DNA为模板,利用PCR扩增tbpA基因,然后将其克隆至pET-SUMO载体,构建重组原核表达质粒pET-SUMO-tbpA,通过PCR鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,并进行IPTG诱导表达和His-Ni-resin纯化目的蛋白。经SDS-PAGE检测,获得了110ku的表达产物,与预期大小的转铁结合蛋白A(TbpA)的分子质量一致。Western-blot分析表明,表达产物与HPS阳性血清能发生反应,显示表达产物具有良好的免疫活性。结果表明,成功表达的TbpA为研制HPS新型疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌Neu基因的克隆表达及表达产物的免疫原性

为研究副猪嗜血杆菌(HPS)基因工程疫苗,以HPS5型毒株为模板,通过PCR扩增获得副猪嗜血杆菌神经氨酸酶(Neu)全基因,将其克隆至pMD18-T载体并对其进行测定和分析。结果表明,Neu全基因含一个2187bp的开放阅读框,编码一含729个氨基酸的蛋白,与Neu基因参考序列(登录号:NZ-ABKM01000006)的同源性为99.0%。以pMD-Neu基因为模板,重新设计引物,扩增得到HPSNeu蛋白的部分编码区,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建得到重组原核表达质粒pET-Neu。将pET-Neu在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行优化表达,经SDS-PAGE分析,重组蛋白Neu主要以包涵体形式表达,分子质量为52ku;Western-blot分析表明,重组蛋白Neu能与阳性血清发生特异性抗原反应。将纯化重组蛋白Neu试验性注射免疫昆明小鼠,攻毒试验结果显示,氢氧化铝佐剂组的保护性较低,仅有10%;而弗氏佐剂组具有较高的保护性,保护率高达60%。     

芽孢杆菌CY1-3株碱性纤维素酶基因celC的克隆及其在大肠杆菌中的表达

芽孢杆菌CY1-3株基因组DNA经Sau3AⅠ部分消化后回收2~7 kb片段,构建了部分文库。通过刚果红染色鉴定,筛选出6个纤维素酶基因的阳性克隆子,经酶切鉴定为同一克隆子,命名为pGJc-1。经测序分析,该片段包含一个由1 593个核苷酸组成的开放阅读框(ORF),命名为celC。经推导,celC基因编码由一531个氨基酸残基组成的CelC蛋白。氨基酸序列分析表明,CelC蛋白的氨基酸序列与多种细菌的-β1,4-内切葡聚糖酶具有很高的同源性。粗酶液的SDS-PAGE分析表明,celC基因在大肠杆菌中所表达的CelC蛋白具有纤维素酶活力,其分子质量约为58 ku。     

应用RAPD技术分析禽多杀性巴氏杆菌广西分离株的DNA多态性

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术 ,以随机引物单条或成对组合的方式对 9株禽巴氏杆菌 (PM )广西分离株和 3个参考株的DNA进行了多态性分析。结果显示 ,在选用的 2 0个引物中 ,有 4对引物 (4条引物成对组合 )扩增的条带为 1～ 16条 ,其长度在 90～ 2 6 0 0bp。相似指数分析显示 ,PM广西分离株GX2与GX4的相似指数最高 ,为 0 .97;GX7与B2 6T12 0 0的相似指数最低 ,为 0 .2 1,C4 8 1标准强毒株与PM广西分离株间的相似指数为 0 .33～ 0 .6 4。表明广西当地的流行株呈现多样性 ,与PM标准强毒株存在差异。     

猪和鸡血浆中硫酸黏杆菌素浓度的高效液相色谱-荧光检测

采用甲醇-100g/L三氯乙酸混合液(二者体积比为50:50)提取血浆中的硫酸黏杆菌素,用邻苯二甲醛进行柱前衍生。荧光检测,激发波长344nm,发射波长436nm。流动相为V乙腈:V0.01mol/L磷酸缓冲液=68:32,流速为1.4mL/min。猪、鸡血浆中硫酸黏杆菌素浓度为0.1～4μg/mL时,硫酸黏杆菌素与其峰面积之间存在良好的线性关系(r2=0.997),最低定量限为0.1μg/mL。血浆中添加0.1、0.5、2.0μg/mL浓度的硫酸黏杆菌素,其回收率70%,变异系数均10%。结果表明,建立的猪和鸡血浆中硫酸黏杆菌素浓度的高效液相色谱-荧光检测方法重复性好、灵敏度高、操作简便,可用于猪和鸡血浆中硫酸黏杆菌素浓度的测定。     

一株鸭源巴氏杆菌强毒株的分离鉴定及致病性研究

为确定导致山东某地区种鸭发病的病原,从病鸭肝、心、肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征培养特性、生化试验结果及PCR鉴定,确定为禽多杀性巴氏杆菌。致病性试验结果表明,1.3×109CFU/m的菌液10倍系列稀释后,感染20日龄健康雏鸡和1日龄健康雏鸭,该分离菌对20日龄健康雏鸡和1日龄健康雏鸭的半数致死量分别为10-4.5CFU/mL、10-5.3CFU/mL;死亡雏鸡(鸭)的剖检病变与发病鸭类似并分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对头孢曲松、氨苄西林、阿莫西林、环丙沙星、卡那霉素等较为敏感。     

浙江省副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

从浙江省5个县(区、市)疑似患有多发性浆膜炎和关节炎猪的98份病料中分离到26株细菌,通过细菌形态、培养特性和生化特性观察以及PCR鉴定最终确定为副猪嗜血杆菌。对26株已确定为副猪嗜血杆菌的分离株进行了血清学分型和药敏试验。结果显示,分离到的26株副猪嗜血杆菌分离株中,4型8株,5型6株,12型5株,13型2株,其余5株无法分型,并且副猪嗜血杆菌对头孢类药物、氟喹诺酮类药物及庆大霉素敏感,对复方磺胺类药物、大环内酯类抗生素及氯霉素敏感性略有不同,对四环素、氨苄青霉素具有耐药性。试验结果对浙江省猪场副猪嗜血杆菌病的防治提供了指导依据。