二温式多重PCR同时检测鸡的6种呼吸道病病原方法建立

设计了6对分别针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、鸡毒霉形体(MG)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、新城疫病毒(NDV)和滑液霉形体(MS)的特异性引物,根据反转录聚合酶链反应(RT-PCR)原理和多重PCR原则,优化建立了一次PCR反应同时检测6种禽呼吸道病原的二温式多重PCR.该方法可同时扩增出6条区段大小与设计相符的特异性片段,即IBV 1720 bp、AIV 1050 bp、MG 732 bp、ILTV 647 bp、NDV 310 bp、MS 207 bp,对人工感染鸡临床样品检测结果证明,该方法可用于临床诊断.     

我国部分地区新城疫病毒分子流行病学研究

将来自江苏、浙江、上海、福建、江西和新疆6省(市、自治区)的10株新城疫病毒(NDV)分离株经克隆纯化,用反转录PCR扩增其F基因9×102bp片段,测定序列,通过与国内外已发表的NDV F基因部分序列进行比较,测定的10个分离株分别属于Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ3个基因型.其中近年流行的基因Ⅲ型病毒与同属于该型的经典强毒F48E8的同源性较低,约为92%;明显小于近年流行的基因Ⅲ型毒株之间的同源性(＞99%);近年分离的NDVⅥ型毒株之间的同源性和Ⅶ型NDV毒株之间的同源性为92%-96%.从各毒株的分离时间来看,新基因型NDV毒株不断出现,而原有的NDV强毒也能分离到.     

鸡肾型传染性支气管炎地方株分离鉴定

自黑龙江省牡丹江、密山两地自然发病鸡场分离到2株病毒.经鸡胚连续盲传至第5代时出现胚体蜷缩成团状、暗淡无光,头、翅、肢有出血点.经理化测定试验、气管环感染试验、回归试验等检测,鉴定分离的2株病毒为鸡肾型传染性支气管炎病毒株,暂定名为MK、M2.     

猪囊虫病基因工程疫苗的生产工艺研究

从重组抗原的表达、复性与纯化、疫苗的配制及疫苗的质量控制等4个方面对猪囊虫病基因工程疫苗的生产工艺进行了探索.确定重组抗原表达的最佳培养液为LB磷酸盐培养液,诱导剂为10g/L乳糖,并根据接种量、溶解氧、罐压、发酵时间等对发酵结果的影响,确定了发酵培养的最佳条件.在重组抗原的复性与纯化方面,工程菌的裂解条件为先用溶菌酶感作再用超声波破菌,超声强度为240W 5次;包涵体的纯化先采用低浓度的尿素洗涤2次,再以5 g/L Triton X-100洗涤1遍,包涵体纯度可达50%以上;重组抗原的复性以静置缓慢透析或分步稀释法为佳,复性液为含2 mol/L尿素、160μmol/L PEG 4000、1.0 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG的pH 9.0 50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA缓冲液;重组抗原的纯化采用分子筛凝胶层析和离子交换凝胶层析的色谱组合,重组抗原的纯度达90%以上.此外对该疫苗进行了中试生产,共生产7批,产品全部合格,表明该生产工艺稳定,可批量化生产.     

蓝舌病病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

以纯化的蓝舌病病毒(BTV)11型VP7免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,借助间接ELISA筛选,获得了3株分泌抗BTV11 VP7的群特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,命名为C12D9、B4 F3、E1 A7.这3株杂交瘤细胞株连续传代3个月再经液氮冻存6个月后复苏培养,仍能稳定分泌特异性McAb.3株McAb均具有ELISA特性和免疫沉淀特性,其中C12D9株上清液的ELISA效价为1256,腹水的ELISA效价为10-6.亚类鉴定,C12D9株为小鼠IgG1,B4F3、E1 A7为IgG2a和IgG2b.琼脂免疫扩散试验和间接ELISA试验表明,这3株均与BTV11型VP7发生特异性反应,为BTV群特异性McAb.     

鸡传染性腔上囊病超强毒致弱株疫苗的研制

以国内分离的鸡传染性腔上囊超强毒(vvIBDV)G株的致弱株Gt为种毒研制疫苗,实验室免疫效力试验和安全性试验表明,该疫苗对雏鸡的最适免疫剂量为50万PFU/只,免疫后7 d开始产生抗体,14 d时抗体阳转率为100%,对强毒攻击的保护率为100%以500万PFU/只的剂量免疫雏鸡,不引起腔上囊病的临床症状和病理变化,对雏鸡安全可靠;现地应用证明,对肉用鸡免疫一次可保护至其出栏.     

基因Ⅶ型新城疫病毒融合前构象F蛋白的表达及结构分析

目前,新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的融合前构象是未知的,为获得具有融合前构象的NDV F蛋白,本研究对基因Ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的F基因胞外区编码序列进行了修饰和密码子优化,将其克隆至真核表达载体中构建获得了重组质粒pCAG-optiF.通过SWISS-MODEL网站对蛋白结构进行预测,结果...     

伪狂犬病病毒gM蛋白多抗的制备及功能探究

为获得免疫原性好的伪狂犬病病毒（PRV）gM蛋白和制备特异性的多克隆抗体,以用于gM蛋白功能的初步研究,本试验截取gM蛋白优势抗原区的碱基序列并插入pET-21a（+）载体,构建原核表达质粒pET-21a-UL10,测序正确后转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。通过尿素法纯化蛋白,将获得的重组蛋白免疫6周龄雌性新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用PRV-UL10真核质粒转染和PRV感染后的细胞样本进行间接免疫荧光、Western-blot和免疫沉淀试验检测其反应性和特异性。使用gM蛋白免疫C57BL/6小鼠后攻毒检测小鼠死亡率。结果显示,成功构建了表达PRV gM蛋白的重组质粒pET-21a-UL10,在37℃诱导6 h后主要以包涵体形式表达;制备的gM蛋白多克隆抗体具有良好的反应性和特异性,可特异性检测到PRV-UL10真核质粒转染和PRV感染细胞中的gM蛋白;小鼠免疫结果显示,gM蛋白诱导的免疫抗体对PRV感染的保护率低。研究表明制备的gM蛋白多克隆抗体具有较好的反应性和特异性,但其对小鼠的保护力较弱,为进一步解析gM蛋白的生物学功能奠定了必要的基础。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒及鉴别类NADC30毒株的双重荧光定量PCR方法

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）保守区和类NADC30毒株的双重TaqMan探针荧光定量PCR方法,分别针对保守的N蛋白基因和Nsp2基因设计特异性引物和探针,通过优化反应体系及反应条件对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估。结果显示,双重标准曲线的相关系数（R2）均大于0.990,具有良好的线性关系;最低检测限分别为5.27 copies/μL和3.00 copies/μL,具有较高的灵敏度;不与其他常见猪病病原发生非特异反应,且重复性良好,批内批间变异系数均小于3%。对168份临床样本的检测结果显示,PRRSV总阳性检出率为68.45%(115/168),其中类NADC30检出率为32.14%,混合感染率为20.24%,与临床诊断结果相一致。结果表明,本方法可用于检测PRRSV和鉴别类NADC30毒株以及猪繁殖与呼吸系统综合征的流行病学调查。     

牛结节性皮肤病病毒ORF006蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究牛结节性皮肤病病毒（LSDV）ORF006蛋白的生物学功能,制备了ORF006基因的多克隆抗体,用PCR技术获得LSDV ORF006的基因片段克隆至pET-28a原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,LSDV ORF006基因全长约696 bp;pET-28a-ORF006重组质粒在大肠杆菌中于37℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h,成功表达约28.0 ku目的蛋白;ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶102 400;Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别ORF006蛋白;间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别LSDV感染MDBK细胞表达的ORF006蛋白。本研究为进一步探究LSDV ORF006蛋白生物学功能奠定了基础。