猪生殖与呼吸综合征病毒CH-1a株GP5蛋白基因的表达及其单克隆抗体的制备

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株GP5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1载体上,并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现,融合表达的rtGP5蛋白约42 ku,将融合蛋白rtGP5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分析,证实所表达的融合蛋白能被其特异性识别。收获融合表达产物rtGP5,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化,经腹腔免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,分别以融合蛋白rtGP5和GST蛋白为抗原,通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测,筛选阳性克隆,结果得到了15株能稳定分泌抗rtGP5蛋白抗体的阳性细胞克隆株。经间接免疫荧光检测发现,获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性荧光。15株单克隆抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型,且轻链均为κ链。     

胸膜肺炎放线杆菌apx I A基因在不同宿主系统中的表达及密码子偏好性分析

用PCR方法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型参考株APP259的基因组DNA中,扩增了约954 bp的apx I A基因片段,分别构建了大肠杆菌表达栽体pGEX-4T-1/apx I A和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apx I A.对目的基因密码子偏好性进行了分析,发现其中有4个大肠杆菌稀有密码子,占1.2%;有49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4%.利用所构建的大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apx I A和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apx I A分别进行表达.结果显示,目的基因在大肠杆菌中能以包涵体形式进行高效表达,其融合蛋白占菌体总蛋白的32%;在毕赤酵母中则以较低水平分泌表达至培养基的上清液中,40倍浓缩后方能检测到少量目的蛋白.证实,目的基因序列中的密码子偏好性影响其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达.     

猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性

应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白Dnak C末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h.用BugBusterTM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性.     

疫情考验下的人类命运共同体建设

新冠肺炎疫情发生以来,全球合作抗疫与人类命运共同体成为人们关注的热点问题。团结协作是战胜疫情的唯一出路,人类命运共同体理念为当前国际社会抗击疫情指明了方向,已成为越来越多人的共识。当下,我们要对一些西方国家出现的民族主义情绪、意识形态偏见以及逆全球化思潮的泛起保持高度警惕,坚持推动构建人类命运共同体,与各国团结合作,携手应对全球性生态危机,共同维护国际公共卫生安全。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

采用超声裂解的副猪嗜血杆菌菌体上清作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法.通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度80μg/mL;37℃作用2 h后4℃过夜包被,待检血清的稀释度为1:320,抗原抗体反应时间为1 h,酶标二抗稀释度为1:15 000,作用时间为1 h,底物显色时间为15 min.待检血清S/N值≥2.5时判为阳性,S/N值<2.5时判为阴性.特异性、重复性和敏感性试验以及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法的特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查.     

猪轮状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的A群猪轮状病毒(PoRV)代表株OSU毒株序列,针对VP7基因设计了1对特异性引物,将150bp目的片段与pMD18-T载体连接构建标准品,建立了检测A群PoRV的SYBR GreenⅠreal-timePCR方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评价。结果显示,该方法在1.3×108copies/μL～1.3×102copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限为1.3×101copies/μL;用该方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪病毒性腹泻病毒均为阴性;批内及批间变异系数均低于2%。表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好。用该方法抽检58份疑似病例的腹泻病料,结果检出53份阳性,同时用普通RT-PCR和快速检测试剂盒对这些病料进行检测,结果分别检出42份和32份阳性。用这3种方法对11例已知阳性的临床粪便样品进行检测,结果建立的检测方法与其他两种方法的符合率为100%。用该方法检测PoRV细胞培养物中的病毒载量为1.0×105copies/μL。结果表明,建立的检测方法为PoRV的早期诊断、分子流行病学调查以及疫苗质量的监测等提供了新的快速检测技术。     

牛支原体肺炎PCR诊断方法的建立及初步应用

参照GenBank中牛支原体脂蛋白P48基因序列,设计并合成特异性引物Mb-F/Mb-R,建立了牛支原体PCR检测方法,并在扩增条件优化的基础上,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,进而应用建立的方法完成了疑似牛支原体肺炎临床病料的检测。结果显示,建立的PCR方法对牛支原体的核酸样品能扩增出534 bp的特异性目的片段,而对无乳支原体、丝状支原体、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、肺炎克雷伯氏菌、黏质沙雷氏菌、变形杆菌等牛常见条件病原微生物核酸样品均未见明显的扩增条带,且其可检测出的牛支原体DNA最低浓度约为0.000 002 875μg/mL。对临床样品的检测结果显示,该方法的检出率与与病原分离的符合率为100%。上述结果表明,本研究成功建立了牛支原体PCR检测方法,可用于临床上牛支原体肺炎的快速诊断。     

非鸡胚源细胞对传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定

采用非洲绿猴肾细胞（Ｖｅｒｏ）直接从传染性法氏囊病（ＩＢＤ）死亡小鸡的法氏囊组织中分离到Ｘ毒株和Ｎ毒株，经电镜形态学观察和多项生物学特性试验的结果表明，分离到的Ｘ毒株和Ｎ毒株为传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）血清Ⅰ型     

鸡传染性喉气管炎病毒中国王岗株糖蛋白gB基因克隆及鉴定

以ＰＵＣ１９质粒为载体构建了鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＥｃｏＲＩＤＮＡ文库。根据已经发表的澳大利亚ＩＬＴＶ－ＳＡ２株和英国ＩＬＴＶ－Ｖ８２２株的糖蛋白ｇＢ基因的核苷酸序列，设计并合成了一对引物，以ＩＬＴＶ中国王岗株ＤＮＡ为模板，扩增出１．３３８ｋｂ的糖蛋白ｇＢ基因片段，用ＤＩＧ标记制备成核酸探针，从ＩＬＴＶＥｃｏＲＩＤＮＡ文库中筛选出阳性重组子，得到一个ＥｃｏＲＩ３．０ｋｂ的ＩＬＴＶＤＮＡ片段。经酶切分析表明，该３．０ｋｂＩＬＴＶＤＮＡＥｃｏＲＩ片段含有完整的糖蛋白ｇＢ基因，经ＰＣＲ和核酸杂交表明所克隆的糖蛋白ｇＢ基因是特异的。     

类山羊传染性胸膜肺炎诊断和防治的研究——病原诊断

于1987年从甘肃省陇东类山羊传染性胸膜肺炎流行区采取临床可疑的山羊、绵羊病料,进行了一系列病原诊断研究,结果:排除了相关致病因素,如梅迪,维士那,山羊关节炎脑炎(CAE),衣原体及相关致病菌感染和寄生虫侵袭;最终从21例山羊6/6例绵羊病变肺组织中培养分离出支原体13株/4株,分菌率均在60％以上,分离株经初步鉴定后,经英国国际支原体鉴定中心(NCTC)最终鉴定均为绵羊肺炎支原体(M.ovipneumonia);以分离株人工感染健康山羊7只,绵羊3只,结果6/7的山羊,2/3的绵羊于接种后第14天始形成与自然病例相似的病变,并以7/7山羊,2/3绵羊病变肺组织中收回原接种物;以琼脂双扩散,试管凝集反应及间接血球凝集试验进行抗原性研究结果证明,分离株与绵羊肺炎支原体标准株(y—98)具有共同抗原性。从而不仅首次确证了该地本病是由绵羊肺炎支原体所致,且对山羊和绵羊都具有很高的感染率和较强的致病性。