猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染的6周龄仔猪,于感染前和感染后第3、7和10 d,采用血常规法、SWC3a单色流式细胞术以及CD3/CD4/CD8三色流式细胞术分析了感染猪外周血中白细胞、粒细胞、单核细胞、NK细胞、γδT细胞的含量。结果,感染后第3 d和第7 d,PRRSV感染组、PCV2感染组以及PRRSV+PCV2共感染组猪的白细胞、单核细胞、粒细胞、NK细胞、γδT细胞总数显著下降,并且共感染组比单感染组下降更加严重。结果表明,PRRSV+PCV2共感染对仔猪外周血天然免疫细胞的影响具有协同效应,意味着在感染早期可导致更加严重的先天免疫抑制。     

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86 mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康大白仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)共刺激分子CD80-CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明,在感染后第3 d和第7 d CD80与CD86 mRNA转录显著下调(P<0.05),感染后第14 d CD86 mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80 mRNA转录水平在第14 d和第28 d高于对照组,CD86 mRNA转录水平在第28 d高于对照组,两者在第42 d均高于对照组,但无显著差异。证实,PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PAM的抗原呈递能力受到影响。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

猪血管内皮细胞体外生长特性的研究

试验以体外分离培养的猪血管内皮细胞为材料 ,研究了细胞的生长曲线、不同基础培养基对细胞生长的影响及胰岛素在生长液中的适宜含量。结果表明 ,传代猪血管内皮细胞接种后有1d左右的滞留期 ,然后细胞进入对数生长期 ,可持续 2d ,第 5d进入平台期 ,第 8d细胞开始脱落死亡 ;与MEM相比 ,M 199更适合于用作培养猪血管内皮细胞的基础培养基 ;在不用贴附基质和内皮细胞生长因子 (ECGF)的条件下 ,生长液中加入胰岛素 ,可明显促进细胞的生长和增殖 ,胰岛素的最适用量为 8μg/mL。     

传染性支气管炎病毒TY1株结构蛋白基因部分片段的表达

根据已报道的传染性支气管炎病毒S基因序列设计了1对引物,利用从传染性支气管炎病毒TY1株中提取的RNA,经PCR扩增获得了300 bp的产物;序列测定与分析表明,所扩增产物是传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的部分片段。将扩增片段插入pET32a构建表达载体,并于大肠埃希氏菌BL21中进行表达;结果表明,该片段在大肠埃希氏菌中成功表达,产物为30 ku、以可溶性形式存在的蛋白。Western-blotting分析表明,该蛋白可与传染性支气管炎病毒TY1株阳性血清发生反应。     

鹌鹑减蛋综合征病毒单克隆抗体的制备及生物学特性

以鹌鹑减蛋综合征QAV C94病毒为抗原免疫BALB/c小鼠 ,制备单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。获得 5株分泌单克隆抗体的细胞株 (命名为H1、H3、H4、H6和H8)。这 5株杂交瘤细胞可长期稳定地分泌单克隆抗体 ,分泌的单克隆抗体为IgG2a亚类 ,具有高度的特异性 ,只特异地作用于鹌鹑减蛋综合征病毒 ;微量血凝抑制试验显示H4有血凝抑制活性 ,腹水效价为 1∶2 6 ;这 5株单克隆抗体都没有沉淀活性 ,也不与CELO抗原发生沉淀反应 ;它们的亲和力以H4最大 ,相对亲和力依次为H4 >H6 >H1 >H8>H3。     

猪三种细胞因子基因的克隆与序列测定

利用RTPCR技术,从植物凝集素(PHA)、脂多糖(LPS)诱导的猪外周血淋巴细胞(PBMC)中成功地克隆了IL2、IL4、IFNα1基因,诱导后第6～24h细胞因子转录基因量最丰富;诱导剂LPS和PHA联合使用的效果优于LPS或PHA单独使用的诱导效果。序列测定与分析表明,克隆的IL2、IL4和IFNα1基因与相应的参考序列的同源性分别是98.5%、99.0%和97.6%。     

Dot-ELISA检测牛白血病病毒抗体的研究

用免疫亲和层析提纯技术获取高纯度的BLV抗原,并用EDTA处理被检血清,以免疫琼扩(ID)的检测结果为标准,建立一种快速特异的斑点酶联免疫吸附试验(Dot—ELISA),用于检测牛白血病病毒(BLV)血清抗体。其检测结果阳性者完全复盖并高于ID试验的检出率。而超出于ID试验的阳性部份,与ELISA法测得阳性结果完全符合。本法比ID试验高5.6％,并可提前60多个小时报告结果。比ELISA法亦可提前十几个小时得出结果。而且不需要特殊仪器设备,是一种特异性强,敏感性良好而且快速的免疫学检测方法。     

番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC蛋白基因的克隆与序列分析

参考已发表的番鸭呼肠孤病毒(mDRV)的S4序列设计了1对扩增σC蛋白基因的引物,对mDRVZJ99株的RNA抽提物进行RTPCR扩增,获得了特异性的扩增片段。将PCR产物克隆测序,序列经同源性比较,发现mDRVZJ99株σC蛋白基因序列与福建MW9710株对应基因的同源性为99.5%,与法国89026株对应基因的同源性为94.2%,与法国89330株对应基因的同源性为95.0%;相应的氨基酸序列同源性分别为98.9%、94.1%、93.7%。基于σC基因及其推导氨基酸序列的蛋白质结构及物理化学性质预测结果,与国外学者对mDRVσC蛋白的报道相似。     

猪源隐孢子虫感染小鼠模型的建立

应用不同醋酸地塞米松剂量和不同猪源隐孢子虫sucp株卵囊剂量建立了昆明系小鼠感染模型。结果表明,用DEX免疫抑制的感染小鼠均排出隐孢子虫卵囊,非免疫抑制感染组和空白对照组小鼠均没有排出卵囊。卵囊排出高峰期平均在感染后第5~12 d,高峰期的OPG值为5.53×105~17.97×105。组织切片和扫描电镜观察结果显示,在十二指肠、空肠和回肠都有隐孢子虫虫体寄生,其中回肠黏膜微绒毛上的虫体数量较多。合适的卵囊和DEX剂量为每只17日龄小白鼠感染10×105个猪源隐孢子虫卵囊和灌胃DEX 0.03 mg/d。