鸭源大肠杆菌ZYD_2与多杀性巴氏杆菌YB_2原生质体融合菌株的鉴定分析

以新霉素标记的ZYD2(NEOs)和YB2(NEOr)作为亲本菌株,培育具有双亲本菌株免疫原性的融合菌株。在溶菌酶作用下,制备两亲本菌株原生质体,聚乙二醇4000诱导原生质体发生融合,利用NEO标记及亲本菌株培养条件不同筛选阳性融合子。ZYD2和YB2可分别得到95.32%和95.25%的原生质体制备率以及32.19%和33.52%的再生率。在含新霉素的麦康凯平板上传代培养获得5株稳定遗传的融合菌株。5株融合菌株可同时凝集双亲本菌株的鸭抗阳性血清。染色镜检观察融合菌株为革兰氏阴性中等大小杆菌。利用双重PCR检测,2株检测到双亲本菌株部分外膜蛋白A(OmpA)基因和部分外膜蛋白H(OmpH)基因,2株只检测到部分OmpA基因,另1株检测不到任何条带。测序结果表明检测到的部分基因片段与亲本菌株的相关基因片段同源性为100%。微量凝集反应显示,外周血可以检测到双亲本菌株抗体,抗体效价在二次免疫后可以维持较稳定水平。结果表明获得5株具有双亲本菌株免疫原性且可稳定遗传的融合菌株。     

鸭病毒性肝炎病毒RNA聚合酶在真核细胞中的表达及亚细胞定位

为研究鸭病毒性肝炎病毒RNA依赖性RNA聚合酶的分子生物学特性及其在细胞中的定位,构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒;然后用脂质体介导转染MDCK细胞。分别使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和蛋白免疫电泳试验等方法检测了RNA依赖性RNA聚合酶在细胞中的表达和亚细胞定位情况。结果表明,RNA依赖性RNA聚合酶能与增强型绿色荧光蛋白一起在MDCK细胞中良好表达,且主要分布于细胞核中,Western-blot分析结果显示,融合蛋白在80ku处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性。表明成功构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现RNA依赖性RNA聚合酶主要在细胞核中发挥复制酶的功能。     

InDel_typer30:用于中国5个主要民族DNA鉴定的多重PCR系统

目的采用插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)多态性遗传标记,建立一种可用于中国汉族、回族、维吾尔族、蒙古族、藏族5个主要民族法医DNA鉴定的多重PCR系统。方法采用人类基因组浏览器和dbSNP数据库筛选具有高度遗传多态性的人类常染色体InDel标记,采用Primer 3软件设计多重PCR引物,通过复合荧光标记系统建立多重PCR扩增体系,采用该体系对汉、回、维、蒙、藏5个民族进行多态性调查。结果成功建立了一个包含30个InDel位点和Amelogenin性别鉴定位点的复合荧光多重PCR扩增体系,命名为InDel_typer30。多态性调查显示这30个InDel位点在上述5个主要民族中均呈高度遗传多态性,平均期望杂合度分别为:0.464、0.460、0.453、0.466和0.469,平均个人识别率分别为:0.595、0.585、0.586、0.589和0.595。该系统在5个民族中的累积个人识别率(CDP)均达到0.999999999996以上。结论 InDel_typer30是一种适用于中国汉、回、维、蒙、藏5个主要民族的法医DNA鉴定系统。     

小鼠肝组织GAPDH mRNA降解与死亡时间关系

目的探讨小鼠在不同的死亡方式下肝组织管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)mRNA降解与死亡时间(postmortem interval,PMI)的关系。方法将60只NIH小鼠分别采用窒息法和断颈法处死,分别置于10℃和25℃温控系统内,利用两步法RT-PCR技术和核酸蛋白测定仪检测小鼠肝组织中GAPDH mRNA在死后0～48h的降解情况。结果在10℃温控系统内的小鼠死后0～48h及25℃温控系统内的小鼠死后0～36h肝组织均可检测到GAPDH mRNA,且其扩增产物呈规律性下降趋势。结论小鼠死亡后肝组织GAPDH mRNA降解与PMI呈负相关,可为PMI推断提供一种新的观测指标。     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

应用多重聚合酶链反应检测四种霉形体的研究

根据鸡毒霉形体 (MG)、滑液囊霉形体 (MS)、衣阿华霉形体 (MI)和火鸡霉形体 (MM )的基因文库 ,设计了 4对分别与MG、MS、MI和MM某段基因序列互补的引物 ,用这 4对引物对同一样品中的MG、MS、MI和MM的DNA模板进行多重PCR扩增。结果 ,均同时得到了 4条特异性的大小与试验设计相符的 732bp(MG)、2 0 7bp(MS)、2 99bp(MI)、85 0bp(MM )多重PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原体的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明 ,此多重PCR能同时检出 1pg的MG、MS、MI和MMDNA模板     

《法医学杂志》常用主题词（三）

正~~     

降解DNA的PCR分型-电洗脱回收大片断DNA法

本文分析了降解ＤＮＡ作ＰＣＲ分型易失败的原因，提出了因小片断ＤＮＡ过多，阻碍引物与膜机的复性及阻断引物延伸的新现点。将降解的ＤＮＡ电泳，切除小片断ＤＮＡ，电洗脱回收较大片断ＤＮＡ，成功地对降解ＤＮＡ进行了ＰＣＲ分型．本方法简便、快速、有效。     

鸡传染性支气管炎北京地方株S_1基因的克隆与鉴定

利用反转录套式聚合酶链反应（ＲＴｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）技术从北京地区３株鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株（ＢＪ１,ＢＪ２,ＢＪ３）中扩增出１０５４ｂｐＳ１基因高变区。利用限制性内切酶ＳｉｎⅠ和ＰｓｔⅠ的酶切位点分析图谱进一步证实了ＲＴｎｅｓｔｅｄＰＣＲ的特异性。将３段Ｓ１基因分别克隆到ｐＵＣ１９质粒中,获得重组质粒ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ１,ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ２和ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ３。     

应用聚合酶链反应检测鸡毒霉形体和滑液霉形体的研究

利用鸡毒霉形体（ＭＧ）与滑液霉形体（ＭＳ）基因一定区域互补的序列,合成能分别针对ＭＧ和ＭＳ目的基因的２对引物。用这２对引物对１０个国际标准的ＭＧ与ＭＳ菌株ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ扩增,结果均得到与预期大小相一致的约７３２ｂｐ（ＭＧ）和２０７ｂｐ（ＭＳ）的ＰＣＲ产物。特异性试验结果表明,这２对引物对其它９种禽病病原ＤＮＡ或ＲＮＡ模板扩增均为阴性;敏感性试验结果显示,ＭＧＰＣＲ能检出１００ｆｇ的ＭＧＤＮＡ,ＭＳＰＣＲ检出量为１０ｆｇ的ＭＳＤＮＡ。