结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法的建立

根据结核分枝杆菌与牛分枝杆菌基因组的比对分析结果,针对结核分枝杆菌与牛分枝杆菌153bp、RD10和TbD1的3处差异缺失区域设计引物,分别建立了结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法.应用建立的3种方法分别对84株结核分枝杆菌、3株牛分枝杆菌、51株非结核分枝杆菌及9种其他常见菌株进行了检测.结果显示,用针对153 bp缺失片段建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出645 bp及492 bp的目的条带;用针对RD10、TbD1建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出478 bp及361 bp的目的条带、358 bp及524 bp的目的条带.这3种PCR检测方法的准确率和特异性均为100%.敏感性试验结果显示,这些检测方法对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌基因组DNA的检测极限均为10 pg.表明,此方法可用于牛源或人源结核分枝杆菌及牛分枝杆菌的快速鉴别检测.     

猪血凝性脑脊髓炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中的猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)S蛋白基因的保守序列设计合成1对特异性引物,经PCR扩增S基因并构建含有该基因片段的重组质粒,将该重组质粒作为阳性标准品,建立了检测HEV的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,相关系数为0.994;敏感性高,检测下限为1.6×104 copies/μL;特异性强,与牛冠状病毒、伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不发生交叉反应;并且重复性好,组内、组间的变异系数均小于2%。应用该方法对采集的20份疑似HEV感染病料进行检测,其中16份为阳性,而用常规PCR检测同样的样品,仅8份为阳性。表明建立的SYBRGreen Ⅰ real-time PCR方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于临床上HEV的检测及定量分析。     

表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

采用荧光染料SYBR Green渗入法,通过对real-time PCR反应条件进行优化,建立了real-timePCR检测方法,用该方法定量分析新城疫病毒(NDV)F基因在重组鸡痘病毒(rFPV-F-VP0)第1、5、10、15、20代次中的表达整合情况。结果表明,建立的标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。在线性浓度范围内,随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,0.99<相关系数(r2)<1,0.8<扩增效率(E)<1.2,熔解曲线为单一特征峰型。本试验精确定量了外源基因在重组鸡痘病毒中的表达水平,为阐明重组鸡痘病毒的表达机理提供了理论基础。     

广东省东莞市犬狂犬病的流行病学调查

调查了广东省东莞市2008年犬的饲养情况及2006年的免疫情况;应用ELISA对2006～2007年采自东莞市32个镇区的1 772份犬血清样品进行了狂犬病病毒抗体效价的检测;采用RT-PCR方法对2006～2007年采自上述区域的104份犬脑组织样品和789份犬唾液样品进行了病原学检测.结果,全市共养犬10万多只,其中农村和城镇各占50%,狂犬病疫苗的注射率约为83.5%.1 772份犬血清样品中,免疫合格率为52.31%,其中2006年的免疫合格率为35.92%,2007年的免疫合格率为70.69%;893份犬脑组织和唾液样品中,狂犬病病毒的阳性率为1.57%.结果表明,2007年东莞市犬的狂犬病免疫水平有大幅度提高,当地犬可能携带狂犬病病毒.     

液氮冷冻单根毛发根直接PCR进行DNA分型

首次用液氮冷冻单根毛发根，再经三次94℃高温处理，直接PCR扩增，从68根毛发根中，成功地检测了62根毛发根的人类vWF基因40内含子VNTR，检出率达91．2％。本方法简便、快速、实用，在法医学检验及群体遗传学研究中有重要应用价值。     

扩增Amelogenin基因用于生物检材种属鉴定

目的扩增Amelogenin基因测定血痕或组织的种属,以确定在法医学检验中的应用价值。方法收集猪、羊、马等10几种常见动物的血痕或肌肉组织,应用PCR扩增Amelogenin基因,PAGE电泳,银染后观察结果。结果哺乳动物猪、牛、狗、羊、马、驴动物血痕扩增产物为1条带,片段长度102bp。猕猴检见106bp和112bp两条带,与人血痕没有区别。兔、猫、鼠血痕未检出特异性片段。其它常见物种鳝鱼、青蛙、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、麻雀等均未见扩增产物。结论扩增Amelogenin基因进行种属鉴定,方法简单,灵敏度高,可应用于法医检案。     

D18S872基因座在汉、维、蒙古、回族群体中的遗传多态性研究及其应用

目的　调查D18S872基因座在成都汉族 ,新疆维族和蒙古族 ,甘肃回族 4个民族中的遗传多态性 ,获得群体遗传学基本数据。　方法　等位基因分型标准物制备采用分子克隆技术 ,样本基因分型采用PCR和PAG垂直电泳技术、银染显色方法。　结果　获得D18S872基因座等位基因分型标准物及该基因座在 4个群体中的遗传学数据。　结论　结果表明D18S872基因座在法医学个人识别和亲子鉴定中有一定的应用价值。     

河南汉族群体6个STR基因座遗传多态性研究

目的通过研究6个STR基因座FGA,TPOX,D3S1358,vWA,D8S1179,D21S 11的遗传多态性,了解它们在河南汉族人群中的多态分布,与其他群体进行比较,得出遗传距离,并了解它在法医学中的应用价值. 方法采用多聚酶链式反应扩增这6个基因座,采用非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳银染显色分析. 结果得出这6个基因座在河南汉族人群中的基因频率,并计算得出杂合度、个体识别率、非父排除率 ,与其他群体比较得出进化距离. 结论这6个基因座有较高的杂合度,并且具有相对遗传稳定性,在人群中的分布符合Hardy-Weinberge平衡,有较高的法医学价值 ,可以应用于个体识别和亲权鉴定.     

D18S872基因座在汉、维、蒙古、回族群体中的遗传多态性研究及其应用

目的 调查D18S872基因座在成都汉族,新疆维族和蒙古族,甘肃回族4 个民族中的遗传多态性,获得群体遗传学基本数据. 方法 等位基因分型标准物制备采用分子克隆技术,样本基因分型采用PCR和 PAG垂直电泳技术、银染显色方法 . 结果获得D18S872基因座等位基因分型标准物及该基因座在4个群体中的遗传学数据. 结论 结果表明D18S872基因座在法医学个人识别和亲子鉴定中有一定的应用价值.     

沙门菌PCR快速检测试剂盒的研制与应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的沙门菌检测方法,根据沙门菌fimY保守基因序列设计合成了1对引物,建立了快速检测沙门菌的PCR方法,并对反应条件进行优化,组装成快速检测试剂盒。结果显示,所有沙门菌均扩增出526 bp的特异性条带,而非沙门菌均未扩增出任何条带。检测灵敏度达93 CFU,还可检出含3 CFU的样品用BP预增菌的菌液或用MM增菌后的菌液,而且稳定性良好,冷冻至少能保存12个月。采用直接菌体加入法、热裂解法、反复冻融法、CTAB碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板,结果CTAB法效果最好,但操作烦琐,而直接菌体加入法和热裂解法可以达到和柱式试剂盒提取法相同的效果,且操作简便、快速、经济、效果好。通过对临床样品的检测,证实该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点,值得推广应用。