荧光标记STR分型技术检验腐败组织基因型

探讨腐败组织荧光标记STR分型检测技术的应用价值。应用含12个STR基因座及一个性别基因座的2个荧光标记的复合扩增系统,对40例1～6周的腐败肌肉提取的DNA进行扩增,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,PE377测序仪分析基因型。所检测样本在12个STR基因座均扩增出特异性谱带,并可判定其基因型。荧光标记STR检测技术对腐败组织分型可靠,在实际检案中具有较高的应用价值。     

二组分混合DNA样品STR图谱解释

对混合样品STR图谱的结果进行解释。实验模拟二组分DNA混合样品 ,复合扩增荧光检测 10个基因座 ,比较混合样品谱带 ,计算等位基因峰面积比。结果发现 :二组分DNA混合样品的等位基因数增加 ,样品的混合比例不同就出现峰面积的不平衡。在等位基因峰面积比值与样品组分混合比例接近时 ,可由峰面积比值推断混合样品的混合比例。在混合比例为 1∶2 0时 ,基本上检测不到来自少量混合成分的等位基因 ,表现为单一组分图谱 ;在混合比例为 1∶10时 ,含量低的组分的等位基因峰面积接近与主要组分的“Stutter”峰面积 ,与来自主要组分的等位基因峰面积差异很明显。能检出混合样品中少量成分等位基因的最高混合比例为 1∶10     

D4R在METH诱导小鼠成瘾中的调控作用研究

目的 探讨脑内多巴胺D4受体（dopamine D4 receptor, D4R）对小鼠甲基苯丙胺（methamphetaine,METH）成瘾行为学和分子生物学的影响,综合分析D4R在小鼠METH成瘾过程中的调控作用。方法 首先将C57BL/6小鼠随机分为生理盐水组（S组）、METH对照组（M组）和D4R配体干预组进行条件性位置偏爱（conditioned place preference, CPP）实验,分析D4R配体对METH成瘾小鼠CPP表达的影响;CPP测试结束后立即剥离所有小鼠的脑核团组织（前额叶皮质、伏隔核、海马和中脑腹侧被盖区）,提取RNA进行实时荧光定量PCR检测,分析METH成瘾小鼠各脑区D4R基因表达的差异性。结果 D4R配体对小鼠测试期总活动量无影响,但可以显著促进实验小鼠CPP的表达;METH成瘾小鼠各脑区内D4R mRNA表达水平与S组相比显著增加,D4R配体干预组实验小鼠各脑区D4R mRNA表达水平与M组相比显著降低。结论 本研究发现METH可导致成瘾小鼠相关脑区核团内D4R表达水平代偿性升高,D4R在METH成瘾过程中发挥重要作用。D4R激动剂和拮抗剂...     

猪轮状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的A群猪轮状病毒(PoRV)代表株OSU毒株序列,针对VP7基因设计了1对特异性引物,将150bp目的片段与pMD18-T载体连接构建标准品,建立了检测A群PoRV的SYBR GreenⅠreal-timePCR方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评价。结果显示,该方法在1.3×108copies/μL～1.3×102copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限为1.3×101copies/μL;用该方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪病毒性腹泻病毒均为阴性;批内及批间变异系数均低于2%。表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好。用该方法抽检58份疑似病例的腹泻病料,结果检出53份阳性,同时用普通RT-PCR和快速检测试剂盒对这些病料进行检测,结果分别检出42份和32份阳性。用这3种方法对11例已知阳性的临床粪便样品进行检测,结果建立的检测方法与其他两种方法的符合率为100%。用该方法检测PoRV细胞培养物中的病毒载量为1.0×105copies/μL。结果表明,建立的检测方法为PoRV的早期诊断、分子流行病学调查以及疫苗质量的监测等提供了新的快速检测技术。     

反向表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒Bartha-K61株的构建

为构建以伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株为载体的反向表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(rgp)的重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,经酶切鉴定为反向连接,阳性重组子命名为p8AA-EGFP/rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得rPRV/EGFP/rgp重组病毒.对纯化后的重组病毒进行RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光鉴定.结果表明,重组病毒的效价(TCID50)为108.25/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性.     

微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫SYBR Green real time PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的隐孢子虫小亚基rRNA基因序列设计1对引物,并以标准基因组DNA为模板,初步建立了检测乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的SYBR Green real time PCR方法,并对乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫阳性样品和上海40份乳牛粪便进行了检测.结果表明,此次建立的real timePCR对微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫均能扩增出曲线,且其他寄生虫(鸡贝氏隐孢子虫、刚地弓形虫、犬新孢子虫)和大肠杆菌均未检测到;标准基因组DNA的检测阈值达到5个拷贝,牛粪中卵囊的最低检测量为每克粪便5个卵囊,乳牛粪便阳性率为15%(6/40).表明,建立的荧光定量PCR快速、特异、敏感,可用于乳牛隐孢子虫病的流行病学调查.     

猪血凝性脑脊髓炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中的猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)S蛋白基因的保守序列设计合成1对特异性引物,经PCR扩增S基因并构建含有该基因片段的重组质粒,将该重组质粒作为阳性标准品,建立了检测HEV的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,相关系数为0.994;敏感性高,检测下限为1.6×104 copies/μL;特异性强,与牛冠状病毒、伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不发生交叉反应;并且重复性好,组内、组间的变异系数均小于2%。应用该方法对采集的20份疑似HEV感染病料进行检测,其中16份为阳性,而用常规PCR检测同样的样品,仅8份为阳性。表明建立的SYBRGreen Ⅰ real-time PCR方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于临床上HEV的检测及定量分析。     

山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达

为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达.通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和RPO30...     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。