ASFV毒力蛋白MGF360-9L降解宿主蛋白MATR3促进病毒复制的研究

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染所引起的一种高度致死的传染性疾病。ASFV多基因家族编码的MGF360-9L已被证实是ASFV重要的毒力蛋白,是ASFV逃逸宿主天然免疫应答的关键之一。本实验室的前期研究基础表明,宿主细胞核基质蛋白3(Matrin 3,MATR3)可能是MGF360-9L的相互作用蛋白之一,但这种相互作用未经验证。此外,MGF360-9L和MATR3之间是否存在相互调控,对于病毒复制或宿主免疫有何意义尚不可知。因此,本研究首先通过免疫共沉淀（Co-immunprecipitation,Co-IP）验证MGF360-9L与MATR3的相互作用;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹（Western-blot）分析ASFV野生型病毒株（ASFV-WT）、ASFV MGF360-9L缺失毒株（ASFV-ΔMGF360-9L）感染或MGF360-9L过表达对MATR3表达的影响;通过RT-qPCR、Western-blot以及分析ASFV荧光重组毒株复制...     

停乳链球菌GapC的免疫特性分析及B细胞抗原表位的筛选与鉴定

旨在表达牛乳源停乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GapC）,预测并鉴定其B细胞抗原表位。本研究采用PCR扩增停乳链球菌GapC基因,构建重组质粒p ET-28a-TR-X16087-2。经IPTG诱导表达后纯化GapC蛋白,并以纯化的GapC蛋白免疫小鼠,采用ELISA方法检测Ig G抗体效价及抗体分型,分析对小鼠的免疫保护效力。结果显示,成功表达了大小为44 ku的GapC蛋白,对小鼠的免疫保护率为76%。预测并筛选出3个B细胞抗原表位,鉴定了1个优势抗原表位BP3:196PHRGGDLRRARAGAAN206。上述结果表明,本研究成功表达了停乳链球菌GapC蛋白,对其免疫效果进行了评估,预测与鉴定了其B细胞表位,为GapC蛋白功能和表位疫苗的研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒M1249L基因编码蛋白的序列分析和结构预测及亚细胞定位

为了解非洲猪瘟病毒（ASFV） M1249L基因及其编码蛋白pM1249L的结构和功能,本研究从NCBI数据库中采集100个ASFV毒株基因序列,对这些毒株的M1249L基因序列及氨基酸序列进行比对并构建分子进化树;进一步分析M1249L基因及p M1249L蛋白的理化性质,预测pM1249L蛋白的二级结构,预测并验证pM1249L蛋白在胞内的分布,验证p M1249L蛋白的泛素化修饰。结果表明,本实验室所使用毒株CN/GS/2018的M1249L基因与ASFV II型毒株同源性最高,相似度为99.87%;氨基酸序列比对结果表明,pM1249L蛋白较为保守;物理性质分析显示,p M1249L蛋白较为稳定,无跨膜区,无核定位序列及信号肽;化学性质分析显示,pM1249L蛋白具有磷酸化、泛素化、糖基化修饰位点;p M1249L蛋白以α-螺旋为主;激光共聚焦试验证实pM1249L蛋白分布于胞质;免疫共沉淀试验表明,pM1249L蛋白能够发生泛素化修饰。通过网站预测及试验验证,本研究全面分析了p M1249L蛋白的理化特性,为阐明其发挥功能的结构基础提供了相关数据。     

长角血蜱Ykt6蛋白抗东方泰勒虫感染的生物学效应

为了解Ykt6基因在蜱体中影响东方泰勒虫感染的生物学效果,通过长角血蜱实验室培养株和野外株,评估Ykt6蛋白对东方泰勒虫侵染长角血蜱过程中蜱的存活率、繁殖率以及对东方泰勒虫感染率等指标的生物学效果。结果显示,Ykt6基因参与了东方泰勒虫与长角血蜱之间的宿主-寄生虫相互作用。Ykt6基因的表达水平与东方泰勒虫在长角血蜱体内的存活和繁殖能力密切相关,当该基因表达水平降低时,东方泰勒虫的存活率和繁殖能力显著下降。进一步的研究发现,Ykt6基因的变异可能影响东方泰勒虫与长角血蜱之间的相互作用。一些野外长角血蜱个体具有Ykt6基因的突变,导致东方泰勒虫在长角血蜱体内的存活和繁殖能力显著下降。这一发现提示,Ykt6基因的变异可能是东方泰勒虫入侵长角血蜱的一个关键因素。总之,Ykt6基因对东方泰勒虫入侵长角血蜱具有重要影响。通过研究Ykt6基因的功能和变异,可以深入了解东方泰勒虫与长角血蜱之间的相互作用,为控制东方泰勒虫入侵提供新的思路和方法。这将有助于保护人畜健康和生态环境的平衡。     

细胞自噬相关蛋白ATG9A对口蹄疫病毒侵入的影响

为揭示细胞自噬相关蛋白9A(ATG9A)对口蹄疫病毒（FMDV）复制的影响,利用IFA、RT-qPCR和Western-blot等方法检测FMDV与ATG9A的共定位情况以及病毒感染对ATG9A的影响;通过构建ATG9A重组表达质粒和合成小干扰RNA,检测过表达及敲降ATG9A对FMDV吸附、内化、基因组复制、蛋白翻译、子代病毒粒子产生的影响。结果显示,FMDV感染后与ATG9A共定位且抑制ATG9A的表达;ATG9A不影响FMDV的吸附,但极显著地抑制FMDV的内化过程;同时,过表达（或干扰）ATG9A能够在RNA与蛋白水平显著降低（或提高）FMDV的增殖和子代病毒粒子产生的能力。结论,ATG9A抑制FMDV的复制,为深入认识FMDV在细胞内的复制周期提供了线索。     

中国共产党的机遇思想

机遇是客观事物发展过程中,由诸多因素相互作用、相互影响而出现的一个天时地利人和的最佳时期.事物的发展是必然性和偶然性的统一,机遇是事物发展的偶然性的表现.马克思说:"如果'偶然性'不起任何作用的话,那么世界历史就会带有非常神秘的性质."[1](p393)能否抓住机遇,不仅是关系到工作的主动还是被动、事半功倍还是事倍功半的大问题,更是关系到我们事业兴衰成败的大问题.中国共产党领导中国人民把握机遇、利用机遇,在中国革命和建设实践中创造了一个又一个奇迹.     

副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的原核表达与鉴定

为获得副猪嗜血杆菌(HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物,根据GenBank发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成1对特异性引物,以HPS血清13型安徽分离株(LJ3)的基因组DNA为模板,利用PCR扩增tbpA基因,然后将其克隆至pET-SUMO载体,构建重组原核表达质粒pET-SUMO-tbpA,通过PCR鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,并进行IPTG诱导表达和His-Ni-resin纯化目的蛋白。经SDS-PAGE检测,获得了110ku的表达产物,与预期大小的转铁结合蛋白A(TbpA)的分子质量一致。Western-blot分析表明,表达产物与HPS阳性血清能发生反应,显示表达产物具有良好的免疫活性。结果表明,成功表达的TbpA为研制HPS新型疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

利用RT PCR技术 ,用包容口蹄疫病毒完整VP1基因的引物从口蹄疫分离株 (China/99 2 )中扩增得到一约 75 0bp的DNA片段 ,克隆后 ,经对该片段的核苷酸序列进行测序和同源性比较 ,显示其与国外同源参考序列 (O1K/66)的同源性为 80 .44% ,与国内同型参考株 (HB/WH/99)的核苷酸序列的同源性达 99.0 6%。随后以重组质粒pGEM VP1为模板 ,用特异性表达引物扩增得到目的基因VP1 (65 0bp) ,对目的基因和表达载体 pGEX 4T 1分别以相同的限制性内切酶酶切后构建成重组表达载体 ,转化宿主菌BL2 1 (DE3 )后得到重组质粒pGEX VP1 ,经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序证明目的基因正确插入到表达载体。用IPTG诱导VP1基因的表达 ,收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳、Western blotting分析检测。结果表明 ,结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中表达 ,表达产物的分子量约为 5 3ku ,并能被口蹄疫阳性血清所识别。经薄层扫描分析 ,表达蛋白约占菌体蛋白总量的 2 0 .0 0 %。证明口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中高效表达 ,且表达产物有一定的生物学活性     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39特异性单克隆抗体的制备

为了制备乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位特异性单克隆抗体,将编码乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39的DNA序列进行人工合成,随后插入表达载体pGEX-6p-1的限制性酶切位点BarnH I与Xho I之间,构建了表位肽与GST的融合表达质粒.该表位融合蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合.以化学合成的E39表位多肽为抗原,对融合细胞上清进行间接ELISA筛选.结果,筛选出1株分泌E39表位特异性抗体的杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞分泌抗体能力稳定.经鉴定,该单克隆抗体亚型为IgG2b,轻链类型为k链.结果表明,用表位融合蛋白为抗原可以制备表位特异性单克隆抗体.     

猪IFN-γ基因的融合表达及其表达产物的生物学特性

依照猪IFN-γ(pIFN-γ)成熟蛋白基因序列设计引物,将已扩增的pIFN-γ基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了GST-pIFN-γ融合表达载体,该载体转化宿主菌BL21后用IPTG进行诱导表达并对诱导表达条件进行了筛选和优化,筛选出最佳诱导表达条件后大量诱导表达,可溶性的表达产物经GST琼脂糖凝胶亲和纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化.经SDS-PAGE和Western-blot分析,证实得到了高纯度的融合蛋白,该蛋白的分子质量为42ku.选择FMDV和PRV两种不同的病毒(RNA病毒和DNA病毒)进行GST-pIFN-γ抗病毒活性测定.结果表明,GST-pIFN-γ融合蛋白可有效抑制这两种病毒引起的细胞病变,其对FMDV的抑制作用远远大于对PRV的抑制.对GST-pIFN-γ融合蛋白的稳定性及机体毒副作用的研究表明,该pIFN-γ的稳定性有较大提高,而毒副作用大大降低.