鸡毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20的克隆表达与蛋白定位

克隆、表达毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20,检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫子孢子的总RNA为模板,用RT-PCR扩增EnsHsp20基因后,连接至pGEM-T Easy载体;测序后构建pET28a(+)-EnsHsp20表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3);经双酶切和测序鉴定后,将重组菌诱导表达;表达产物经Western-blot鉴定、纯化与复性后,免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗rEnsHsp20多克隆抗体;利用多克隆抗体,分别用Western-blot和间接免疫荧光试验检测子孢子和第2代裂殖子中EnsHsp20的天然蛋白及其定位;最后,应用qRT-PCR分析EnsHsp20基因在未孢子化卵囊、子孢子和第2代裂殖子中的转录水平。结果显示,该基因全长549 bp,编码183个氨基酸,预测分子质量为20.3 ku;重组蛋白主要以包涵体形式存在,可以被6×His标签单抗和鸡抗毒害艾美耳球虫、抗柔嫩艾美耳球虫、抗堆型艾美耳球虫和抗巨型艾美耳球虫的阳性血清识别;在第2代裂殖子中检测到EnsHsp20的天然蛋白,分子质量约为36 ku;EnsHsp2...     

猪丹毒杆菌表面抗原SpaA的原核表达纯化及免疫原性验证

本研究制备了一种具备优良免疫原性的猪丹毒杆菌表面抗原重组蛋白。采用基因调取的方式,构建质粒并亚克隆到表达载体pET28a上,进一步将改造质粒转化到大肠杆菌感受态BL21细胞中,构建了1株猪丹毒SpaA全基因重组表达菌株。之后通过IPTG诱导表达、镍离子层析柱分离纯化、梯度透析获得高纯度重组SpaA蛋白。经免疫攻毒试验验证,重组SpaA蛋白能够有效保护小鼠和猪免于猪丹毒杆菌强毒攻击,其中小鼠的重组SpaA蛋白最小免疫剂量为每只2.0μg,100μg的重组SpaA蛋白能够保护猪免于猪丹毒杆菌强毒株感染。以重组SpaA蛋白作为组分与猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗共同免疫小鼠,结果显示该混合疫苗对于猪丹毒杆菌及猪多杀性巴氏杆菌均有良好的保护效果。本研究结果证实,重组SpaA蛋白是我国现行猪丹毒杆菌传统灭活疫苗升级换代的理想候选抗原,同时也具备良好的抗原相容性,其高纯度及低免疫剂量的特点也为其他组分提供了充足的剂量空间。     

优化运用教学方法的几个问题

教学方法是指为了实现教学目标,在教学原则的指导下,对所采取的教与学相互作用活动的总体考虑与实施。教学方法作为教学目的实现的重要手段,其对于教学的重要性是众所周知的。教学过程的艺术,就是教师驾驭教学方法的艺术。[1]在实施教学时,教师能否正确选择教学方法,是影响教学质量的关键问题之一。教学的成败在很大程度上取决于教师能否妥善地选择教学方法。教学方法的选择建立在教师自己对知识接受的亲身体验及多年教学的经验总结和不断探索的基础上,实践证明,教师只有综合考虑教学的各种相关因素,优化选择、运用恰当的教学方法,才可望达…     

猪流行性腹泻病毒重组S1蛋白的免疫原性评价

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株S1基因经密码子优化后克隆到慢病毒表达载体,在293T细胞包装PEDV S1重组慢病毒;重组慢病毒感染293T细胞,经有限稀释法筛选获得高效稳定表达S1蛋白的重组细胞系HEK-293T-S1;生产、纯化S1蛋白,添加佐剂制备成重组S1亚单位疫苗,经肌肉注射免疫实验用巴马小型猪,评价...     

旋毛虫FYVE锌指结构蛋白基因的克隆及表达

用旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库中的T54克隆作为核酸探针,对旋毛虫成虫和新生幼虫混合cDNA文库进行筛选,获得1个全长1464 bp的cDNA分子.该cDNA含有1个1290 bp的开放阅读框架(ORF),Blastn同源性分析表明,与其它已知生物基因序列无明显的同源性,为一新的cDNA.该ORF编码1个429个氨基酸残基组成的多肽,其分子质量理论推导值为49.9 ku,等电点为5.6,在12-14及103-105氨基酸残基处分别有2个糖基化位点NLS及NVS,在C末端344-409氨基酸残基处有1个FYVE锌指结构域(Profile PS50178).Blastp同源性分析表明,与广东管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)66.0 ku蛋白(gi/1743430)同源性最高,为39.0%.在此基础上对旋毛虫FYVE锌指结构重组蛋白进行了表达,表达蛋白占茵体蛋白的24%.     

大黄泄浊颗粒保留灌肠对非透析慢性肾脏病肾性骨病湿热证患者骨密度及血清骨形成蛋白-7的影响

目的观察非透析慢性肾脏病(chronic kidney diseases,CKD)肾性骨病湿热证患者腰椎骨密度(bone mineral density,BMD)和血清骨形成蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)水平及大黄泄浊颗粒保留灌肠的干预作用。方法将64例非透析CKD 3~5期湿热证患者随机分为治疗组和对照组各32例(结果每组失访2例),并设正常组20例。两组均给予基础治疗,治疗组加用大黄泄浊颗粒保留灌肠,每日1次,疗程均为8周。治疗前后分别观察两组血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN),血清肌酐(serum creatinine,SCr)、钙(calcium,Ca)、磷(phosphorus,P)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、甲状旁腺激素(parathyroid hormone,iPTH)、BMP-7水平及第2—4腰椎BMD。结果治疗组临床疗效显著优于对照组(P0.05)。治疗4周末和8周末,两组中医证候积分均较前一时点显著降低(P0.05),且治疗组积分均显著低于对照组(P0.05)。治疗组在降低BUN、SCr和血清P、iPTH、ALP方面,以及在升高血清Ca和肾小球滤过率估算值方面均显著优于对照组(P0.05)。与正常组比较,CKD病例组BMD和BMP-7均显著降低(P0.05);两组治疗后BMD和BMP-7均显著升高(P0.05),而治疗组BMD和BMP-7升高值均显著大于对照组(P0.05)。结论非透析CKD肾性骨病湿热证患者BMD和BMP-7水平均显著低于健康人群;大黄泄浊颗粒保留灌肠可防治非透析CKD肾性骨病,其机制可能与改善肾功能及升高血清BMP-7含量有关。     

扬子鳄Mx基因的原核表达和纯化及其多克隆抗体的制备

扬子鳄Mx以蛋白质的形式发挥其抗病毒功能,本试验通过构建pET28a-Mx质粒,将其转化入大肠杆菌感受态细胞中,用IPTG诱导其进行蛋白大量表达,并纯化蛋白。将纯化好的蛋白作为抗原,与弗氏佐剂充分乳化,免疫6周龄的BALB/c雌性小鼠,4次免疫后提取其血清,测定效价。应用Western-blot检测制备的鼠抗扬子鳄Mx多克隆抗体的特异性。结果显示,扬子鳄Mx蛋白原核表达载体构建成功,并且应用切胶纯化的方式成功纯化了该蛋白。制备的鼠抗扬子鳄Mx多克隆抗体的效价达1∶51 200以上。本试验研究结果为进一步研究扬子鳄Mx蛋白的抗病毒功能提供了物质条件。     

蛋白同化制剂和肽类激素进出口管理办法

国家食品药品监督管理总局中华人民共和国海关总署令国家体育总局令第9号《蛋白同化制剂和肽类激素进出口管理办法》已于2014年6月27日经国家食品药品监督管理总局局务会议审议通过,并经海关总署、国家体育总局同意,现予公布,自2014年12月1日起施行。食品药品监管总局局长张勇海关总署署长于广洲体育总局局长刘鹏2014年9月28日第一条为规范蛋白同化制剂、肽类激素的进出口管理,根据《中华人民共和国药品管理法》、《中华人民共和国海关法》、《反兴奋剂条例》等法律、行政法规,制定本办法。第二条国家对蛋白同化制剂、肽类激素实行进出口准许证管理。     

电针内关对心肌缺血大鼠电压门控钾离子通道蛋白的影响

目的研究电针内关穴对心肌缺血大鼠心肌细胞电压门控钾离子通道相关蛋白表达的影响,比较循经取穴与其他取穴方法的差异。方法健康雄性SD大鼠(SPF级)随机分成对照组、模型组、内关组、列缺组、非经非穴组,通过注射盐酸异丙肾上腺素制作动物模型,Western blot检测Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KCh IP2、Kir2.1、Kir2.2六个指标,观察电针前后各组大鼠心肌细胞电压门控钾离子通道相关蛋白表达量的变化情况。结果与模型组比较,内关组和列缺组蛋白表达量均升高(P<0.05),非经非穴组与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05),内关组的蛋白表达量高于列缺组,但低于对照组(P<0.05)。结论电针内关穴和列缺穴均可以提高心肌缺血大鼠心肌细胞电压门控钾离子通道相关蛋白的表达量,且心包经内关穴的针刺效应优于列缺穴。     

法治现代化需要一部“百科全书”

依法治国与国家治理是相互作用、相辅相成的关系。依法治国是推进国家治理现代化的重要内容和主要途径，而推进国家治理体系和治理能力现代化，核心是要推进国家治理法治化。坚持和实行依法治国，可以从宪法、法治、立法、依法执政等多方面推进国家治理现代化和法治化。为此，应当根据推进国家治理现代化的改革总目标，强化法治权威和良法善治，加强人民代表大会制度建设，完善法律体系，加强宪法和法律实施．推行法治建设指标体系，在加快建设法治中国进程中推进国家治理现代化。