猪链球菌血清2型环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立快速、灵敏的猪链球菌血清2型(SS2)LAMP检测方法,根据GenBank登录的SS2特异的荚膜多糖(cps2 H)基因序列作为检测靶标,在其序列的保守区域设计LAMP引物,利用参考菌株S735基因组DNA为模板进行扩增,优化了LAMP的反应条件和反应体系,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果,利用建立的LAMP方法对SS2进行扩增,扩增产物显色呈现阳性反应,电泳出现阶梯状条带,最低检测量为0.186fg/μL模板DNA,比常规PCR高1 000倍;且与其他常见的细菌无交叉反应。结果表明,建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速和重复性强等优点,适用于猪链球菌病的实验室快速检测。     

猪链球菌2型mrp基因ORF1序列的克隆及原核表达

根据猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因(mrp)的序列,设计并合成了1对特异性引物,以青海株的基因组DNA为模板扩增了mrp基因ORF1序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a( )中,构建了原核表达质粒pET-28a-mrp,并将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(27.0 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有MRP的抗原表位。研究结果为今后开展该病的免疫学研究奠定了一定基础。     

猪链球菌抗体GDH重组蛋白PPA-ELISA检测方法的建立

以纯化的猪链球菌重组谷氨酸脱氢酶(GDH)蛋白作为包被抗原,酶标葡萄球菌A(PPA)蛋白为二抗,建立了检测猪链球菌抗体的间接PPA-ELISA诊断方法。经方阵滴定确定了抗原的最适包被浓度为12.5mg/L,血清样品的最佳稀释倍数为1∶80,PPA-ELISA阳性反应的临界值为D450nm≥0.378,交叉反应试验结果表明,该重组抗原与其他常见的6种猪病的阳性血清不发生交叉反应,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。经与武汉科前动物生物制品有限责任公司的商品化猪链球菌抗体检测试剂盒比较,二者的符合率为96.7%;对320份血清进行猪链球菌抗体检测,阳性检出率为73.1%。试验证明,所建立的PPA-ELISA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高,为大规模地进行猪链球菌病的流行病学调查和血清学诊断提供了有效的技术手段。     

猪和兔附红细胞体的体外培养

用RPMI1640和小牛血清按不同比例混合作为体外培养猪和兔附红细胞体的基础培养基,同时以去掉红细胞上自然感染的附红细胞体后的红细胞泥作为培养附红细胞体的寄生载体,进行猪和兔附红细胞体的体外培养。培养结果表明,以 RPMI1640 与小牛血清按 6∶4 比例混合,同时选用兔红细胞泥作为载体的培养效果最佳,接种感染了附红细胞体的猪、兔阳性红细胞后 24 h生长达到高峰,感染率分别为40.2%和31.0%,而采用猪红细胞泥作为培养载体时红细胞感染率无明显升高。     

利用随机扩增多态性DNA指纹技术对猪链球菌进行基因分型

通过优化反应条件和筛选随机引物 ,应用 10 0条随机引物对分离的 2 0株猪链球菌做随机扩增多态性DNA(RAPD)分型研究。结果表明 ,有 2 7条引物呈现良好的多态性和稳定性 ,可产生稳定、复杂的指纹图谱。采用SPSS10 .0软件分析了不同菌株之间的遗传距离 ,绘制出了菌株间的亲缘关系树状图 ,结果 ,2 0株猪链球菌被分为 4个聚类群     

四川省仔猪球虫病的流行病学调查

20 0 2年 7～ 9月抽样调查了四川省 12个市、县 16个猪场的球虫病流行情况。结果 ,仔猪球虫阳性场占 93.75 % (15 / 16 ) ,仔猪球虫总感染率为 2 5 .36 % (10 7/ 4 2 2 ) ;猪等孢球虫阳性场占87.5 0 % (14 / 16 ) ,猪等孢球虫总感染率为 18.72 % (79/ 4 2 2 ) ;在球虫阳性的仔猪粪样中初步鉴定出5种球虫 ,即粗糙艾美球虫、蒂氏艾美球虫、猪艾美球虫、豚艾美球虫及猪等孢球虫。     

附红细胞体感染对猪红细胞免疫功能的影响

对急性附红细胞体病猪的红细胞免疫功能进行了检测。结果显示,感染附红细胞体病猪的RBC CR1花环率显著下降,RBC IC花环率变化不明显。表明附红细胞体侵袭红细胞的同时,破坏了红细胞膜表面的C3b受体,红细胞膜表面游离状态的C3b受体数量明显减少,导致机体红细胞的免疫黏附活性降低,红细胞免疫功能低下。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测及其序列分析

根据猪链球菌 2型的溶血素基因合成了一对可扩增长度为 14 96bp目的片段的引物 ,建立了检测溶血素基因的PCR方法。该方法对猪链球菌 2型参考株SS2 N株的检测结果为阳性 ,对马链球菌兽疫亚种 (C群 )参考株ATCC3 5 2 46、分离株SESZ Y、SESZ T、SESZ C和猪葡萄球菌、大肠埃希氏菌的检测结果均为阴性 ;用EcoRⅠ内切酶进行酶切 ,获得了与预期结果一致的 863bp和 63 3bp的 2个片段。经对SS2 1株的PCR产物进行测序及序列分析 ,表明其与 193 3株、P1/ 7株的核苷酸同源性分别为 99.7%和 10 0 %。