禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因真核表达载体的构建

应用限制性内切酶BamHⅠ将片段ompH从重组质粒pMDT-omp H切下,非定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定,证实成功构建了禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因的重组真核表达质粒pcDNA3-ompH。将重组表达质粒转染至 COS7 细胞,经RT-PCR、SDS-PAGE及Western-blotting检测,证明了外膜蛋白H基因获得了瞬时表达。     

狂犬病病毒核蛋白和糖蛋白基因的克隆及其腺病毒穿梭载体的构建

用狂犬病病毒CVS毒株经小鼠脑腔攻击后从发病鼠脑组织中提取总RNA,用带接头的特异性引物分别扩增出了狂犬病病毒核蛋白(N)基因和糖蛋白(G)基因。将N基因和G基因分别克隆入质粒载体pMD18T后,对筛选的含有N基因和G基因的重组质粒进行了全基因序列测定和分析。随后将狂犬病病毒N基因和G基因分别从其各自的克隆载体上双酶切消化,同时亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV。经卡那霉素抗性和酶切筛选,最终成功构建了含有N基因和G基因的重组穿梭载体pAdTrackCMVNG。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA 2.5kb基因片段的分子克隆及其表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内分离株721株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出ApxⅣA基因2.5kb特异片段,将其克隆于pMD18T中,经酶切鉴定筛选重组质粒后进行核苷酸序列测定,并与GenBank中登录的血清1型ApxⅣA(AX002405)基因进行比较,结果显示核苷酸同源性为99.5%。将该片段亚克隆到原核表达载体pGEX6P1的EcoRⅠ/SalⅠ位点,成功地构建了重组表达载体pGEXapxⅣA,并转化大肠埃希氏菌BL21,获得了表达。SDSPAGE检测结果显示,表达的融合蛋白分子质量约为117ku,与预期片段大小相符;Westernblotting分析证实,该融合蛋白具有免疫学活性。     

基因科技的法律问题研究——“发明”基因?“发现”基因?

发明和发现是专利法理论中的两个概念,一般认为,发明指的是设计和制造前所未有的东西;发现则是揭示出已有的,但人们尚不知道的东西。随着基因科技的发展,人们对是否应授予基因专利争论的沸沸扬扬,其焦点主要在于对基因属于发现还是发明认识不一。通过比较和分析各方观点,我们认为在对待基因是否具有可专利性时,应淡化发明与发现的区别,而专注与实质性审查。     

鸡毒霉形体耐氟喹诺酮类gyrA基因的突变特征

按常规方法提取鸡毒霉形体 3株临床分离株和参考株 (S6 - 10 )的基因组DNA ,扩增各菌株DNA旋转酶gyrA基因片段 ,并克隆、测序 ,用DNAsis软件对测序结果进行分析。结果表明 ,HS1、HS2株均在GyrA亚基第 87位发生了Glu87→Gly氨基酸取代 ,除此之外 ,耐药水平较高的HS2株还在第 83位发生了Ser83→Ile氨基酸取代 ,而FL分离株虽对氟喹诺酮类药物产生了低水平耐药 ,但在GyrA亚基未发生任何氨基酸突变。     

牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达。提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体。     

鸡IL-18基因重组真核表达载体的构建及其表达产物的生物学活性

从pMDChIL18克隆质粒扩增获得了ChIL18全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1( )。经酶切、质粒PCR鉴定和基因测序,鸡IL18全基因被正确重组到pcDNA3.1( )真核表达质粒上;将重组真核表达质粒pcDNA3.1( )ChIL18转染COS7细胞,转染细胞中含ChIL18基因的mRNA。SDSPAGE分析表明,表达产物是与ChIL18相符的约23ku的蛋白条带。鸡淋巴细胞转化试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。     

鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDVVP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDVVP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku。     

猪胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因原核表达载体的构建及其表达

经PCR从含有APXⅡA基因片段的重组质粒 pT APXⅡA中扩增出了APXⅡA基因。同时对目的基因和表达质粒 pGEX 4T 1进行了双酶切 ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析 ,证明连接向位和阅读框架正确。成功构建了APXⅡA基因的原核表达载体 pGEX APXⅡA。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE分析表达目的蛋白。结果表明 ,蛋白质的分子质量为 10 2 .5ku。     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建

采用RT PCR技术从长白猪的肌肉组织中扩增出了泛素 (Ubiquitin)基因 ,并将其克隆到 pGEM Teasy载体 ,经测序表明 ,所克隆的基因与GenBank中已登录的序列同源性达 99%。利用设计的融合表达引物 ,分别将泛素基因与猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV )GP5蛋白成熟肽基因进行扩增 ,用重叠区扩增基因拼接法将 2个基因片段进行拼接 ,并插入真核表达载体 pcDNA4 .0HISMAXA中 ,构建出了 pcDNA U GP5重组质粒。