NSP-ELISA鉴别FMDV感染与免疫

利用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒 (FMDV)非结构蛋白 (NSP) 3ABC多肽作为抗原 ,建立了一种可区分FMDV感染与接种灭活疫苗免疫牛的间接酶联免疫吸附试验 (I ELISA)。通过对 336份正常牛血清、50 8份注射疫苗牛血清、60份人工感染牛血清和 58份豚鼠免疫血清的检测 ,确定了血清抗体阴性与阳性效价的临界值。试验证明 ,该方法简易、快速 ,灵敏度比VIAA AGID高     

水泡性口炎病毒N基因的克隆及其PCR检测方法的建立

根据国外发表的水泡性口炎病毒 (VSV)基因组核苷酸序列 ,设计了 2对特异性引物 ,通过RT PCR方法得到N基因。将此基因与 pGEM TEasyVector相连 ,通过蓝白斑筛选出阳性克隆 ,碱裂解法小剂量提取质粒。经测定 ,N基因与参考序列同源性高达 99%。同时根据克隆产物进行亚克隆 ,建立了VSV的PCR检测方法。     

猪脑心肌炎病毒P1和P12A3C基因重组腺病毒的构建及其在小鼠体内的免疫应答

为研制脑心肌炎病毒(EMCV)新型活载体疫苗,首先将病毒核衣壳前体多肽P1与P12A3C串联基因分别插入穿梭质粒pDC316中,构建得到了重组穿梭质粒pDC316-P1和pDC316-P12A3C。将其分别与辅助质粒pBHGloxΔE1、3Cre共转染293细胞,成功包装出重组腺病毒Ad-P1和Ad-P12A3C。免疫过氧化物酶单层试验确证,重组腺病毒可表达目的蛋白。分1次和2次肌肉注射免疫小鼠,然后通过间接ELISA试验和中和试验评价其诱导的特异性体液免疫水平。结果,Ad-P1诱导的VP1特异总抗体IgG水平显著高于Ad-P12A3C,但不能检测到明显的中和抗体(<1∶8);Ad-P12A3C能诱导产生良好的中和抗体(1∶32~1∶128),用1×108TCID50剂量EMCV BJC3株攻毒,Ad-P12A3C免疫组能获得100%的保护,而Ad-P1免疫组仅能获得部分保护。以上结果表明,Ad-P12A3C可作为良好的EMCV腺病毒活载体疫苗。     

禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

为了能快速准确地对禽流感进行病原学诊断,根据流感病毒的M基因序列,在保守区内用Oligo4.0软件设计了1对引物,建立了一步法RT-PCR诊断方法,其目的片段大小为229 bp。通过对不同稀释倍数的H5亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,结果显示,病毒尿囊液的最低检出稀释度为1∶104;阳性棉拭子的最低检出稀释度为1∶23。用病毒分离法和一步法RT-PCR同时检测人工感染鸡不同脏器、口咽及泄殖腔棉拭子样品,二者符合率为100%,但前者的检测灵敏度比后者高10~100倍。用该方法检测H1~H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,所有禽流感病毒均有229 bp的目的条带出现,而其他14种禽病病原均无目的条带出现,表明该方法的特异性好。     

禽流感病毒A/Turkey/Canada/63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp,编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示,该毒株HA基因属于H6亚型,NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析,表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80.5%～87.3%,氨基酸的同源性为88.0%～93.1%；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86.0%～93.5%,氨基酸的同源性为90.6%～96.3%。     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA复制非必需区的筛选

提取山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA,用HindⅢ酶切,随机克隆到pUC18质粒中,限制性内切酶片段电泳分析和序列测定结果表明,克隆到4个不同大小的HindⅢ片段pUA、pUB、pUC和pUD。随后,将它们和羊痘病毒Pellor(AY077835)株进行了同源性比较,发现核苷酸同源性为90.0%~94.5%,氨基酸同源性为83.0%~91.4%。选取克隆或亚克隆后的单一酶切位点,插入P11P7.5-LacZ报告基因,构建了pUA1、pUB1、pUC1和pUD1共4个重组载体质粒。通过脂质体分别转染山羊痘病毒感染的BHK-21细胞,在X-gal存在条件下经蓝白斑筛选重组病毒,获得1株重组病毒,证明筛选出了1个复制非必需区片段。     

Tat蛋白对马传染性贫血病毒长末端重复序列启动子活性的影响

将来源于马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株第25代和第118代病毒的LTR,白细胞弱毒(EIAV-DLA)的LTR,以及TAR起始碱基和/或poly(A)附加位点发生突变的驴胎皮肤细胞弱毒(EIAV-FDD)的LTR分别克隆到pCAT3-Basic质粒中,获得了6个重组质粒pCAT-25、pCAT-118、pCAT-FD、pCAT-G219A、pCAT-A294C和pCAT-G219A-A294C。同时用pcDNA3.1(+)构建了EIAV反式激活蛋白(Tat)基因的重组真核表达质粒pcTM7-D。将pcTM7-D分别与含有不同LTR的重组质粒共转染驴胎皮肤细胞,考察Tat对LTR启动子活性的增强作用。结果表明,在皮肤细胞中Tat蛋白可以特异性增强来源于皮肤细胞弱毒疫苗株LTR的启动子活性,而对白细胞源的LTR无明显增强作用;TAR起始位点和poly(A)的单碱基突变和联合突变对Tat的反式激活作用并无明显影响。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了 1对PCR引物 ,以伪狂犬病病毒Ea株 (pseudorabiesvirusEa ,PRVEa)基因组DNA为模板 ,扩增出一大小为 5 11bp的片段。通过酶切和测序证实 ,该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因 ,即gL基因。Blast软件分析表明 ,该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为 94% ,氨基酸序列的同源性为 95 %。将测序结果输入GenBank ,获得登录号AF44 845 6。     

鹅副黏病毒对鸽的致病性研究

用鹅副黏病毒BY株人工感染 1月龄鸽 ,观察试验鸽的发病情况、临床症状及病理变化 ,并对病毒抗原的组织分布进行检测 ,以研究鹅副黏病毒对鸽的致病性。结果表明 ,鹅副黏病毒人工感染可致试验组鸽严重发病 ,发病率达 10 0 % ,致死率达 92 % ;病鸽表现下痢、眼睑发炎、呼吸困难、咳嗽 ,并表现瘫痪、翅膀下垂、转圈或震颤等神经症状 ;病鸽各种器官都存在组织损伤 ,但以消化系统、免疫系统和神经系统较为严重 ,表现显著的变性、坏死或出血等变化 ;病毒可以在病鸽体内多种组织器官中复制。这说明 ,鹅副黏病毒对鸽具有较强的致病性