羊口疮病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用

参照GenBank中登录的羊口疮病毒(ORFV)序列(Gu320351),针对OrfV的B2L基因保守区域设计了4条引物,通过优化反应条件,建立了检测OrfV的环介导等温扩增技术(LAMP),并进行了特异性试验、敏感性试验及临床样本检测。结果显示,用建立的LAMP方法对OrfV阳性样品扩增产物的电泳呈特征性梯状条带,而绵羊痘病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、丝状支原体山羊亚种、山羊痘病毒及健康山羊皮肤的扩增产物电泳后均无扩增条带。建立的LAMP方法对OrfV的最低检出量为5.3fg,比常规PCR方法高1 000倍。表明建立的LAMP方法特异性强,敏感性高。对6份临床样本的检测结果显示,OrfV阳性检出率为83.33%(5/6),与常规PCR的符合率为100%。本试验为羊口疮病例的临床诊断和OrfV的快速检测提供了新的方法。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中的猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)S蛋白基因的保守序列设计合成1对特异性引物,经PCR扩增S基因并构建含有该基因片段的重组质粒,将该重组质粒作为阳性标准品,建立了检测HEV的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,相关系数为0.994;敏感性高,检测下限为1.6×104 copies/μL;特异性强,与牛冠状病毒、伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不发生交叉反应;并且重复性好,组内、组间的变异系数均小于2%。应用该方法对采集的20份疑似HEV感染病料进行检测,其中16份为阳性,而用常规PCR检测同样的样品,仅8份为阳性。表明建立的SYBRGreen Ⅰ real-time PCR方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于临床上HEV的检测及定量分析。     

山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达

为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达.通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和RPO30...     

马流感病毒NP单克隆抗体的制备及特性鉴定

利用原核表达的马流感病毒(EIV)核蛋白(NP)为免疫原,经腹腔接种4周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经4次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得了3株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株2G11、3E10和4A1,并对它们进行了亚类鉴定、间接ELISA检测和特性鉴定。结果显示,单抗2G11为IgG1亚型,3E10为IgG2a亚型,4A1为IgM亚型,轻链均为κ链。单抗2G11、3E10和4A1的细胞上清液及腹水效价分别为1∶640、1∶640、1∶320和1∶409 600、1∶204 800、0。这3株单抗均能特异性识别EIV NP重组蛋白,并且能够与天然EIV结合;获得的3株单抗与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马乙型脑炎病毒均不发生交叉反应。亲和力试验结果显示,单抗2G11和3E10与EIV的亲和力常数分别为4.39×106 M-1和2.20×106 M-1。     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。     

小反刍兽疫病毒H和F蛋白多抗原表位的表达及其反应原性

将通过计算机软件预测并通过间接ELISA检测确定的小反刍兽疫病毒(PPRV)H、F蛋白的10个B细胞抗原表位串联,再加上一个外源通用T细胞表位,表位之间用甘氨酸间隔,人工合成一条多抗原表位编码基因序列,将其插入原核表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)诱导表达。结果获得分子质量为19 ku的表达蛋白,该蛋白可与PPRV感染阳性血清发生特异性免疫反应。结果表明人工合成的PPRV多抗原表位编码基因可以在原核表达系统中表达,表达产物具有反应原性,这为研究PPRV抗原表位疫苗奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株的分离鉴定

为获得1株猪伪狂犬病病毒贵州分离株,将贵阳市某猪场送检的流产胎儿病料经一系列处理后接种Vero细胞,并对分离毒株分别进行了病毒理化特性、电镜形态观察、中和试验、动物接种试验、核酸检测等鉴定。当盲传至第3代时,出现细胞变圆变亮、脱落、呈拉网状特征的细胞病变;分离毒不耐酸和热,对5-碘脱氧尿核苷和有机溶剂氯仿敏感,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;透射电镜下可见位于囊泡中呈近圆形、有囊膜、150～180 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;将分离毒株接种家兔,能引起家兔奇痒、麻痹死亡;PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株。     

印楝种仁粗提物体外抗鸭瘟病毒活性的研究

采用索氏提取法及溶剂萃取法,用950mL/L乙醇提取印楝种仁并萃取,分别得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及水层。采用细胞病变(CPE)法及四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法研究三种萃取物对鸭瘟病毒(DPV)的抑制作用。结果显示,石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及水层对细胞的最大无毒浓度分别为0.007 8、0.003 9和0.125 0mg/mL;当其浓度为0.000 5、0.000 3及0.156 0mg/mL时,对DPV的抑制率各为13.23%、29.24%和11.72%。结果表明,三种萃取物对DPV均有不同程度的抑制作用,其中乙酸乙酯萃取物效果较好。     

表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

采用荧光染料SYBR Green渗入法,通过对real-time PCR反应条件进行优化,建立了real-timePCR检测方法,用该方法定量分析新城疫病毒(NDV)F基因在重组鸡痘病毒(rFPV-F-VP0)第1、5、10、15、20代次中的表达整合情况。结果表明,建立的标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。在线性浓度范围内,随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,0.99<相关系数(r2)<1,0.8<扩增效率(E)<1.2,熔解曲线为单一特征峰型。本试验精确定量了外源基因在重组鸡痘病毒中的表达水平,为阐明重组鸡痘病毒的表达机理提供了理论基础。