猪生殖与呼吸综合征ORF5基因疫苗的构建及其安全性和免疫原性检测

克隆了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SC2株ORF5基因。测序分析表明SC2株属美洲型PRRSV。构建的ORF5基因疫苗经脂质体转染Marc 145细胞后,第26h检测到疫苗蛋白的特异性表达,第56h达到高峰。疫苗肌肉注射小鼠和仔猪后能迅速分布到各组织器官中,未发现核酸疫苗与宿主细胞染色体整合现象;且能使仔猪产生体液和细胞免疫应答,免疫期持续135d以上。结果表明,构建的PRRSVORF5基因疫苗具有良好的安全性和免疫原性。     

DVR标准与应用专题——高标准≠好实用DVR标准与应用

DVR是新世纪数字化安防的宠儿。随着应用领域的不断扩大，DVR的标准也在不断升级和更新。近年，各厂家针对安防行业的实际需要以及不同场所特殊应用提出了技术改进和有益的探索。其压缩标准已经从最初的M-JPEG发展到现在MPEG-1、MPEG-2、MPEG-4、H．263、H．264等多种压缩标准。今后，DVR领域仍然会有许多新的技术和产品出现。我们策划此次“DVR标准与应用”专题的目的，就是为了推动DVR技术的进一步发展，从而促进DVR百花齐放，百家争鸣。     

解决“法律白条”问题要多管齐下——关于“执行难”问题的再思考

作为参与民事诉讼的当事人，收到业已生效的法律文书．之后变成权利人实实在在的权利．才叫打赢了官司。否则，判决书（或裁决书）就是一纸“法律白条”。对此。本人曾在《青海人大》（2004年第2期）发表《“法律白条”何时休》一文，作过初步探讨。今天，再作思考以期引起重视。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及表达

从亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒中提取总RNA,采用反转录聚合酶链反应获得了长度约为700bp的核苷酸片段,大小与预期长度相符。扩增产物经克隆测序,证明其为VP1基因。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX 4T 1,成功构建了重组表达质粒pGEX VP1;利用IPTG诱导,表达出了53ku的目的蛋白条带。Western blotting分析表明,表达产物能与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒抗血清特异性结合。亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP1在大肠埃希氏菌中表达成功。     

藏猪γ-干扰素基因cDNA的克隆及序列分析

将藏猪外周血淋巴细胞进行体外培养 ,在ConA的刺激下培养 70h后 ,提取培养的淋巴细胞总RNA ,应用RT PCR技术扩增藏猪淋巴细胞γ 干扰素cDNA(TPγ INF) ,并克隆到 pMD T载体上 ,进行测序。结果显示 :克隆的TPγ INFcDNA全长为 5 45个碱基 ,ORF为 5 0 1个碱基 ,编码 16 6个氨基酸 ,分子量为 19.4ku ,等电点为 10 .2 9。此cDNA与牛、马的γ INF同源性分别为86 %和 81% ,与猪的γ INF同源性为 10 0 % ,证明克隆到了藏猪的γ 干扰素cDNA。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN6株ORF5基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR方法从河南分离的1株(HN6)猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5),并将其克隆到pMD18-T载体中测序,再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21,用不同浓度IPTG分别于37℃诱导,经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白的分子质量约31.4 ku,薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%。Western-blotting结果表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实,该蛋白可用于PRRSV的诊断。     

微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库的构建

为了研究微小牛蜱功能性抗原基因,从微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱中提取总RNA并分离纯化mRNA。采用Oligo(dT)引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ、HindⅢ定向接头,用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体。经体外包装,成功构建了我国微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库,铺板测定原始库容量为4.5×105PFU,扩增后的滴度为7.2×1010PFU/mL。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株M蛋白基因的克隆及原核表达

构建了TGEV TH-98株M基因序列的原核表达载体,利用RT-PCR方法从TGEVTH-98株中扩增出M蛋白基因,并亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白。结果表明,从TGE TH-98株克隆到了M基因cDNA,该基因全长789 bp,与T014株、Purdue株、TFI株和96-1933株的M基因同源性分别为92.37%、98.35%、99.87%和96.96%。SDS-PAGE电泳结果显示,重组表达质粒获得了约57 ku的目的带,其中M蛋白的分子质量约为31 ku,与预期的结果一致;Western-blotting分析表明,融合表达产物可与TGEV全病毒制备的阳性血清发生反应。证实,TGEV的M基因高度保守,构建的M基因原核表达载体pGEX-6P-TM能在大肠埃希氏菌中获得高效表达。     

乳牛肝MTP基因mRNA定量检测模板的构建

应用RT-PCR方法,克隆394 bp的MTP片段,连接到pMD 18-T载体上构建pMD-MTP394重组质粒;应用限制性内切酶ApaⅠ消化重组质粒pMD-MTP394,切下一194 bp的小片段,回收大的线性片段,T4 DNA连接酶连接,成功构建了一个重组的竞争模板质粒pMD-MTP200,为建立竞争性RT-PCR法检测乳牛肝MTP基因mRNA奠定了基础。     

新兴猪IFN-α成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据NCBI GenBank上登录的猪IFN-α基因序列设计了 1 对引物,应用 PCR技术直接从3周龄新兴猪肝细胞中扩增出了约 500 bp 的基因片段;将该片段克隆到 pMD 18-T 载体,经PCR、酶切及序列测定,该克隆片段由501个核苷酸组成,共编码 166 个氨基酸,与 NCBI GenBank上登录的 2 个猪 IFN-α基因序列(登录号为 M28623 和 X57191)比较,核苷酸的同源性分别为99.4%和99.2%。