猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV-2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析,结果表明,克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92.0%~93.3%,推导氨基酸序列的同源性为82.9%~84.6%。重组质粒pMD18-T-ORF2经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES,成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。     

广西地区2004-2010年猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5及ORF7基因的遗传变异分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子遗传进化情况,对2004-2010年间广西的PRRSV阳性病料进行了ORF5、ORF7基因扩增和序列分析。结果显示,所获得的毒株均属于美洲型毒株,其ORF5基因间的氨基酸序列同源性为89.6%～99.5%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为84.6%～91%、89.6%～95.5%和93%～99%,而与LV的同源性为54.7%～56.7%;ORF7基因间的氨基酸序列同源性为87.1%～99.2%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为91.1%～96%、91.9%～96%和89.5%～99.2%,而与LV的同源性为55.6%～58.1%。基于ORF5和ORF7基因核苷酸序列绘制的遗传进化树,可将所有PRRSV分离株分为4个亚群,广西地区的毒株分布在以CH-1a为代表的Ⅱ亚群、以HB-1为代表的Ⅲ亚群和以JXA1为代表的Ⅳ亚群,以Ⅳ亚群为主。表明当前广西PRRSV流行毒株以美洲型Ⅳ亚群为优势基因亚群,并且各毒株间的ORF5和ORF7基因序列存在一定差异,但没有明显的地域特征。     

猪2型圆环病毒广东株ORF2基因在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR扩增猪 2型圆环病毒广东株ORF2后部一段基因 ,将PCR产物用KpnⅠ和HindⅢ酶切后与同样处理过的 pBAD/gⅢB载体连接 ,转化TOP1 0细胞后挑取阳性克隆 ,酶切鉴定和测序后 ,用L 阿拉伯糖诱导 ,经SDS PAGE和Western blotting分析 ,表明ORF2基因在大肠埃希氏菌中得到了表达 ,表达的多肽为 2 8ku。     

猪戊型肝炎病毒ORF2 C-端主要抗原区的克隆及原核表达

为研究猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2C-端主要抗原区的原核表达产物是否具有抗原性,用PCR技术对猪戊型肝炎病毒ORF2C-端基因进行扩增,经克隆与序列分析,发现该基因片段编码289个氨基酸残基。将该目的片段连接到原核表达载体pET-28a(+)中,转化表达菌BL21(DE3),成功构建了重组质粒pET-HEV-ORF2-C,其重组菌于37℃、0.5mmol/L IPTG诱导表达4h后,菌体裂解物经SDS-PAGE分析,在分子质量约为34ku处出现一新蛋白带,与预期的目的蛋白分子质量相符。质谱鉴定表明,成功地表达了HEV-ORF2C-端蛋白。Western-blot和抗体效价检测分析结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性。     

猪生殖与呼吸综合征病毒M基因和N基因的表达

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M基因和N基因从重组质粒pMD18-T-M-N中亚克隆至pBV220原核表达载体上,成功构建了重组表达质粒pBVM-N。将pBVM-N转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞,重组菌经温度敏感诱导表达,其细菌裂解物经SDS-PAGE可检测到分子质量约为19 ku的目的蛋白,与M基因表达产物一致;经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达19.1%;Western-blotting分析表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,与预期的M基因表达产物相一致,而N基因未获表达。     

猪戊型肝炎病毒广西株ORF2三段连续基因编码蛋白的表达及抗原性分析

为了确定猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2抗原性片段的分布,参考中国T1株序列设计套式引物,从新鲜猪粪中扩增出HEV部分基因片段,长1725bp,位于ORF2第205～1929bp之间,命名为HEVORF2-A。根据HEVORF2-A序列设计了3对引物,分别扩增HEVORF2-A三段连续的基因片段,命名为HEVORF2-B1、HEVORF2-B2、HEVORF2-B3,分别位于HEVORF2-A第1～576bp,577～1149bp,1150～1725bp之间。将这4段扩增的基因片段分别与表达载体pET32a(+)连接,并转入BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析。结果显示,经1mmol/LIPTG37℃诱导6h后,除pET32a-A在82.6ku处有微量融合蛋白表达外,pET32a-B1、pET32a-B2、pET32a-B3分别在41.3ku、41.5ku、41.8ku处有高水平的融合蛋白表达。用自然感染猪血清和北京万泰HEVELISA诊断试剂盒阳性对照血清进行Western-blot分析,结果3个短的融合蛋白均能检测到明显的条带,表明构建的3个表达载体具有良好的抗原性。     

基因Ⅳ型猪戊型肝炎病毒重组ORF3蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

为建立检测猪戊型肝炎病毒(HEV)抗体的间接ELISA诊断方法,将HEV ORF3片段克隆至大肠杆菌表达载体pET42a(+)中,构建了原核表达载体pET42a-ORF3,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,并对表达的融合蛋白进行Ni2+-NTA柱纯化及SDS-PAGE、Western-blot鉴定,用纯化的融合蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA检测方法.结果显示,GST-ORF3在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的蛋白质分子质量约为45.5 ku,具有良好的抗原性.用建立的间接ELISA检测190份猪血清样品,阳性率为84.7%,与试剂盒检测结果相比,阳性符合率为91.5%.表明,建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和灵敏性,可用于猪血清HEV抗体的检测.     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

锦鲤疱疹病毒CJ株ORF83基因的克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF83蛋白的结构特征和进化关系,用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF83基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF83基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的3株KHV构建系统进化树。结果显示,获得了长687 bp的ORF83基因,编码229个氨基酸;编码蛋白的理论分子质量为25 822.18 u,等电点为8.600;疏水性为-2.733～3.100;信号肽切割部位最可能位于第22位的G(甘氨酸)和第23位的V(缬氨酸)之间;跨膜结构分析表明,ORF83有4个跨膜区;抗原表位预测显示,编码蛋白的抗原性良好;结构预测显示,ORF83可能存在1个N-糖基化位点、11个O-糖基化位点和13个磷酸化位点;系统进化树分析显示,KHV-CJ株与锦鲤疱疹病毒美国株和以色列株属同一分支。结果表明,ORF83基因编码的蛋白可能具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体。