猪传染性胃肠炎病毒聚合酶基因反义RNA对病毒的抑制作用

通过PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)聚合酶部分片段,反向插入逆转录病毒表达载体pLXSN中,用脂质体法将重组质粒plxas-pol转染PA317细胞,经抗生素G418筛选出稳定的产毒细胞克隆,分别扩大培养后,取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,细胞克隆产生的重组病毒效价达9.0×105CFU/mL。用高效价假病毒感染IBRS2细胞,再经抗生素G418筛选,提取细胞克隆总RNA,经RT-PCR证明plxas-pol整合入IBRS2细胞。以TGEV感染IBRS2细胞和具有抗性的IBRS2细胞所产生的细胞病变为指标,证明该反义RNA对病毒有明显抑制作用,抑制率约为80%。用2×103和4×102TCID50/mL剂量的TGEV感染时,引起细胞死亡的时间分别为21 h和27 h,与对照组相比,抗性细胞系可明显延迟因病毒感染引起细胞死亡的时间。     

应用反转录-聚合酶链反应检测动物组织中的口蹄疫病毒

应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测了猪和牛的扁桃体、淋巴结、脊髓、肌肉和蹄冠皮肤中的口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）。与接种乳鼠测毒法比较，该方法的灵敏度达０．１６ＬＤ５０～０．３２ＬＤ５０病毒量。检测人工感染后７～３５ｄ的猪组织样品７７份，２５份为阳性；接种乳鼠并盲传３代，乳鼠－间接血凝试验（ＩＨＡ）鉴定６份为阳性。检测人工感染后４～７ｄ的牛组织样品５２份，２０份为阳性；接种乳鼠－ＩＨＡ鉴定１２份为阳性。检测野外鲜肉样品４７份，１２份为阳性；任选其中８份样品接种细胞单层，盲传至第６～７代，先后有５份样品产生ＣＰＥ；其中６份样品同时接种乳鼠，盲传至第６～７代，３组乳鼠出现ＦＭＤＶ致病症状，ＩＨＡ鉴定为阳性。检测冻猪肉样品３７份，３份为阳性；冻牛肉样品９份、冻羊肉样品１０份，均为阴性     

办公自动化系统的安全性探讨

目前办公自动化系统普遍存在着安全性问题,必须从管理安全、环境安全和技术安全三方面入手,实现办公自动化系统中的整体安全。     

狂犬病病毒核蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达

为获得狂犬病病毒(RV)核蛋白抗原,采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了RV核蛋白基因,分别亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,经PCR和双酶切鉴定以及序列测定,重组质粒构建成功。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,表达的核蛋白再经Ni2+-NTA亲和层析纯化。结果显示,核蛋白在pET-32a(+)中的表达量(30.4%)高于在pET-28a(+)中的表达量(19.4%),培养物中的高纯度核蛋白产量分别为13.6和8.45 mg/L。经Western-blotting检测,不同载体表达的核蛋白均可被兔抗RV多克隆抗体特异识别,表明核蛋白具有良好的反应原性。     

利用转基因植物生产口蹄疫可饲疫苗的研究进展与前景

从口蹄疫可饲疫苗的研究概况、生产技术要点、优缺点及需要改进的问题几方面阐述了利用植物反应器生产口蹄疫可饲疫苗的研究前景。综述了口蹄疫可饲疫苗的研究进展,介绍了利用植物反应器生产口蹄疫可饲疫苗的技术要点,包括在口蹄疫病毒遗传转化质粒载体系统中最常用的农杆菌介导法,提出了生产口蹄疫可饲疫苗需要改进的技术问题。     

H9N2亚型禽流感病毒聚合酶基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法对1株H9N2亚型禽流感病毒Ck/GS/2/99株RNA聚合酶基因PB2、PB1和PA分别进行了扩增,将其克隆到pGEM-T easy载体后进行序列测定与分析。结果表明,该株病毒的PB2、PB1和PA基因开放阅读框(ORF)分别由2280、2274和2 151个碱基组成,分别编码759、757和716个氨基酸。经同源性与系统发生树分析,该毒株RNA聚合酶基因PB2、PB1和PA与Ck/NX/4/99株的核苷酸和氨基酸同源性均在98%以上,另外这3个基因与Dk/HK/Y280/97、Sw/HK/9/98和Qu/HK/NT/28/99株的关系密切。     

西尼罗病毒E蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用PCR技术扩增西尼罗病毒(WNV)E蛋白基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-WNV-E,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对诱导条件进行优化,利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE与Westernblot鉴定正确后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示:WNV E蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式被成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体能特异性识别WNV E蛋白。本研究成功表达并纯化了WNV E蛋白,证明该蛋白具有良好的免疫原性,为WNV抗原、抗体检测方法的建立和新型疫苗的研发及相关研究奠定了基础。     

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.     

H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对H9亚型禽流感病毒(AIV)不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×104.7EID50/mL;阳性棉拭子的最低检出量为1×102.5EID50/mL。用该方法检测H1~H15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,结果仅有H9亚型AIV出现特异性目的条带,而其他均未出现目的条带。脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品在1∶10稀释度下,病毒分离和RT-PCR方法可以达到相同的阳性检出率。表明建立的AIV H9亚型RT-PCR方法具有较好的特异性和敏感性。     

慢病毒载体介导的西尼罗河病毒prME蛋白的表达

将西尼罗河病毒(WNV)的主要免疫原性基因prME插入HIV-1慢病毒载体pHR中,构建了转移质粒pHR-WNV/prME。在脂质体介导下,将该质粒与p△8.2、pVSV/G共转染293T细胞,48h后收获细胞上清。将上清转导正常的293T细胞,通过报告基因荧光观察、间接免疫荧光检测。结果表明,利用HIV-1慢病毒载体系统包装得到了假型病毒,可以高效转导293T细胞,并实现了WNVprME基因在被转导细胞中的表达,从而为基于慢病毒载体的WNV新型疫苗的研制奠定基础。