大肠杆菌O157及其Stx2免疫胶体金层析检测方法的建立

建立了大肠杆菌O157和志贺毒素2(Stx2)的双抗体夹心免疫胶体金层析法,并运用该方法对上海市兽医生物技术重点实验室保存的已鉴定的58株大肠杆菌进行了检测,评估了其特异性、敏感性和重复性.结果显示,大肠杆菌O157层析法的敏感性为1×105CFU/mL,特异性为87.5%,批间和批内变异系数分别为8.6%和0;Stx2层析法的检测下限为200μL细菌培养液,特异性为50.0%,批间和批内变异系数分别为50.0%和33.0%.表明,该免疫胶体金层析法能快速、简便、特异地检测大肠杆菌O157;结合对Stx2的检测,能快速检出产Stx2的大肠杆菌O157菌株.     

牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(Gly4Ser)3接头连接,得到了融合基因.将融合基因片段先克隆于pMDl8-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40 ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应.结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性.     

大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染牛和小鼠排菌检测中的应用

为了检验大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染动物排菌中的应用效果,将牛和小鼠采用灌胃攻毒方式试验感染大肠杆菌O157∶H7,用大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养计数以及PCR 3种方法检测感染动物粪便中O157∶H7的排菌量和持续时间。牛在感染大肠杆菌O157∶H7后的第2天开始从粪便排菌,第4天达到峰值,排菌时间可持续28d;小鼠在感染O157∶H7后的第4小时开始从粪便排菌,第6小时达到峰值,排菌时间可持续15d。大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养计数以及PCR 3种方法的检测结果一致,但试纸条更简便、快捷、直观,1～5min可得出检测结果,便于现场检测样品中O157∶H7的快速筛查。     

预防仔猪大肠杆菌性腹泻K_(88)遗传工程菌苗免疫途径和剂量的研究

将61头怀孕母猪分成5个组,给第Ⅰ组皮下注射K_(88)遗传工程菌苗500亿死菌,第Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组分别口服1000亿、500亿和250亿活菌;第Ⅴ组不接种菌苗作为对照。结果各免疫组母猪所生仔猪的发病率明显下降,其中第Ⅲ组的免疫效果最佳。     

产志贺毒素Ⅱ型变异体大肠杆菌LAMP检测方法的建立

为建立产志贺毒素Ⅱ型变异体(Stx2e)大肠杆菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法,参照Gen-Bank中12条Stx2e序列和9条Stx2序列,针对Stx2e基因保守区域设计并合成4条引物,分别进行了反应条件优化、特异性试验、敏感性试验及模拟样品检测。结果显示,用所建立的LAMP方法对阳性样品扩增所得产物电泳后呈特征性梯状条带,阴性样品的扩增产物电泳后均无扩增条带。建立的LAMP方法对Stx2e+大肠杆菌的最低检出量为38CFU/管,敏感性高于PCR方法(3.8×103CFU/管)。LAMP和PCR对模拟样品检测结果的符合率为100%。该研究为仔猪水肿病的诊断和Stx2e+大肠杆菌的快速检测提供了新的方法。