猪带绦虫TS61抗原基因的克隆及表达分析

以PCR扩增猪带绦虫TS61抗原基因 ,与载体 pUC18连接后进行测序 ;并构建了该基因的pGEX 1λT原核表达载体 ,制备了其原核表达产物 ,进行浓度梯度SDS PAGE和免疫印迹分析 ;对该基因的碱基序列及其编码蛋白进行了同源性比较。结果表明 ,猪带绦虫TS61抗原基因含 893对碱基 ,编码含 70个氨基酸残基的多肽 ,分子质量为 8.0ku ,等电点为4.19。在基因库和欧洲分子生物学实验室数据库中均未发现该基因的同源序列。重组质粒在大肠埃希氏菌中表达的融合蛋白分子质量为 3 4ku ,该蛋白抗原能被兔抗猪囊尾蚴超免疫血清所识别。     

大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位基因的克隆与鉴定

根据已发表的大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位 (FedF/ab)的基因 (fedF/ab)序列 ,设计了 1对引物 ,利用PCR技术从大肠埃希氏菌F10 7/ 86、YCED1、YCED2、C、D和 12F株中分别扩增获得了一段序列 ,并克隆至 pGEM T载体 ,获得了重组质粒TF10 7F、TYCED1F、TYCED2F、TCF、TDF、T12FF。经琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析 ,6个重组质粒的大小均为 90 3bp ,与fedF/ab基因大小一致。其中大肠埃希氏菌F10 7/ 86、YCED1、C和 12F株的fedF基因序列完全相同 ;只有YCED2株在第 181位碱基处存在 1个C→T的无义变异差异 ,D株在第 6 5 5位碱基处存在 1个T→C变异差异并在氨基酸水平出现 1个S→P变异。结果表明 ,所克隆的序列均为F18ab菌毛F亚单位的基因     

基因技术的法律保护问题研究

基因工程作为一门新兴技术,备受世人关注。基因技术的应用可能给人类社会带来巨大的社会效益和经济效益,同时也可能给人类社会带来很大的隐患,因而,加强对基因技术的法律保护是非常必要的。     

PCR扩增ZFY/ZFX基因鉴定人类干血痕性别

应用 PCR 技术同时扩增人 ZFY 和 ZFX 基因特异的 DNA 序列,在男性血痕中可检测到两种扩增产物,即340bp 长的 ZFY 基因及488bp 长的 ZFX 基因特异 DNA 片段;在女性血痕中仅可检测到488bp 长的 ZFX 基因特异 DNA 片段,据此判定干血痕性别。干血痕的最小检出需要量为0.125μl 血液量的血痕。室温保存10年的血痕可以准确判定性别。ZFY 基因位于 Y 染色体短臂。本方法同时检测两条性染色体,可以避免由于扩增失败或 Y 染色体长臂变异出现的假阴性或假阳性。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳即可区分。     

伪狂犬病病毒Bartha-K61株TK基因的分离鉴定

提取伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株基因组DNA,用限制性内切酶KpnⅠ充分消化,回收5.9×103b片段(J片段),将其克隆于质粒pUC119 KpnⅠ位点上,获得pBKJ.用一对针对PRV TK基因的特异性引物对重组质粒进行PCR鉴定,证明其中含有PRV TK基因.然后用KpnⅠ、PstⅠ和BamHⅠ等限制性内切酶对其进行酶切分析,确定了克隆片段的物理图谱.进一步研究证实TK基因位于其中的KpnⅠ-BamHⅠ或KpnⅠ-Pst Ⅰ片段中.然后亚克隆此KpnⅠPstⅠ片段,并进行了序列测定.     

气单胞菌aerA和hlyA两基因在溺死诊断中的应用

目的建立溺死尸体脏器气单胞菌气溶素(aerA)和溶血素(hlyA)两基因的PCR-CE检测方法,验证该方法的特异性和灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法设计气单胞菌(Aeromonas)特异性引物aer-A1和hlyA-1,构建PCR-CE方法;扩增52种标准株DNA;确定最低DNA检测浓度;检测16只实验猪和40例真实案件尸体组织样本,分别计算两对引物总阳性率。结果引物aerA-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和温和气单胞菌,产物片段为180bp,灵敏度分别为0.034、0.92ng;引物hlyA-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌,产物片段为150bp,灵敏度分别为0.94、0.034ng。利用aerA-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为70.00%、78.38%;利用hlyA-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为80.00%、83.78%。结论基于气单胞菌aerA基因和hlyA基因建立的PCR-CE检测方法进行溺死诊断,快速灵敏,特异性好,有良好的应用前景。     

鼠伤寒沙门菌yibT基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了探讨yibT基因对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响,采用λ-red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌CVCC541的yibT基因缺失株CVCC541ΔyibT,同时利用表达质粒pET28a构建yibT缺失株的基因回补株CVCC541ΔyibT/pyibT,研究野生株、缺失株、回补株之间的生长特性、生化特性、遗传稳定性、生物膜形成和应激环境抵抗力等生物学特性。结果表明,本研究成功构建了yibT基因缺失株CVCC541ΔyibT及其回补株CVCC541ΔyibT/pyibT,yibT基因的缺失不影响细菌的生化特性,该缺失株具有良好的遗传稳定性,但其生长特性较野生株及其回补株显著减缓,生物膜形成能力相较于野生株及其回补株有所减弱,缺失株在热应激环境以及正丁醇压力下表现出更强的耐受力。综上所述,yibT基因的缺失会影响鼠伤寒沙门菌的生长特性、生物膜形成、应激环境抵抗力和细菌形态等生物学特性,并且yibT基因可能影响鼠伤寒沙门菌菌膜的流动性。     

2017—2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析

为掌握广西猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻样品,应用RT-PCR方法进行检测,并随机选取部分PEDV阳性样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果显示,共获得PEDV S基因序列23株、M基因和N基因序列各25株。同源性分析显示,广西流行毒株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因为90.6%~100%和89.6%~100%,在M基因为97.0%~100%和96.9%~100%,在N基因为95.9%~100%和95.9%~100%。序列比对显示,广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、突变和插入现象,且各毒株之间存在差异。基于S、M、N基因绘制遗传进化树,获得相似的拓扑结构图,广西流行毒株主要分布在S基因的GⅠb、GⅡa亚群,M基因的GⅡa、GⅡb亚群,N基因的GⅢ亚群。遗传进化速率测算显示,广西流行毒株及国内外参考毒株S、M、N基因的平均进化速率分别为7.39×10-4、1.43×10-4和2.96×10-4substitutions/site/year,S基因的变异速度最快。表明PEDV广西流行毒株存在遗传多样性,应加强病原监测和流行病学调查,为有效防控PED提供基础数据。     

狂犬病病毒aG株G基因的克隆与生物信息学分析

为了研究狂犬病病毒aG株的进化情况,分析狂犬病病毒的遗传变异和基因功能,采用BHK-21细胞培养繁殖狂犬病病毒aG株,运用RT-PCR扩增G基因,将其与pMD18-T simple vector连接后转化JM109感受态细胞,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,狂犬病病毒G蛋白基因全长1 575bp,包含1个阅读框(ORF),编码524个氨基酸。生物信息学分析表明,G蛋白的分子质量为58 377.22u,理论等电点为7.080,半衰期为30h(体外哺乳类网状细胞),不稳定系数为42.99,脂肪指数为88.45,总平均亲水性为-0.106,最大疏水性为3.489,最小疏水性为-2.600,信号肽序列为1～19位氨基酸残基,跨膜区结构分析显示该蛋白为跨膜蛋白,预测可能包含有4个N-糖基化作用位点,2处基于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点,13处蛋白激酶C磷酸化位点,12处酪蛋白Ⅱ磷酸化位点;1处酪氨酸激酶磷酸化位点;9处N豆蒄酰化位点;1个酰胺化位点。系统进化分析表明,aG株G蛋白与DRV株进化距离最近。     

牛源犬新孢子虫MAG1基因的克隆及原核表达

为了解牛源犬新孢子虫MAG1基因的免疫学特性,根据MAG1基因序列,设计并合成了1对用于扩增MAG1基因的引物。将PCR扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE结果显示,MAG1在大肠杆菌中获得了较高水平的表达,表达蛋白的分子质量为65ku。Western-blot结果显示,表达的MAG1蛋白可被牛源犬新孢子虫阳性血清特异性识别,表明该MAG1蛋白具有较好的反应原性。本研究为新孢子虫病疫苗及诊断试剂盒的研究奠定了基础。