多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中的猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)S蛋白基因的保守序列设计合成1对特异性引物,经PCR扩增S基因并构建含有该基因片段的重组质粒,将该重组质粒作为阳性标准品,建立了检测HEV的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,相关系数为0.994;敏感性高,检测下限为1.6×104 copies/μL;特异性强,与牛冠状病毒、伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不发生交叉反应;并且重复性好,组内、组间的变异系数均小于2%。应用该方法对采集的20份疑似HEV感染病料进行检测,其中16份为阳性,而用常规PCR检测同样的样品,仅8份为阳性。表明建立的SYBRGreen Ⅰ real-time PCR方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于临床上HEV的检测及定量分析。     

山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达

为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达.通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和RPO30...     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。     

结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析

以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,共获得6株能稳定分泌抗Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H9/1H5、3H9/3C7、4A9/3E2、4A9/3D7、6G7/7B6和6G7/8D3,并通过ELISA、Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对6株单抗的特性和抗原表位进行分析鉴定。结果显示,6株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024～1∶2 048,腹水效价为1∶163 840～1∶204 800。3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3的亚型为IgG1型,4A9/3E2和4A9/3D7为IgG2b型,所有单抗的轻链均为κ型。Western-blotting和IFA结果表明6株单抗均能与重组Cap蛋白和PCV2产生特异性反应。相加ELISA结果显示,6株单抗可能识别不同的抗原表位。为准确鉴别不同单抗针对的抗原位点,以截短表达的重组Cap蛋白为抗原,进行Western-blot鉴定。结果显示,4A9/3E2与4A9/3D7的抗原表位位于101～150aa,其余4株单抗可能针对1～50aa或者天然...     

表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

采用荧光染料SYBR Green渗入法,通过对real-time PCR反应条件进行优化,建立了real-timePCR检测方法,用该方法定量分析新城疫病毒(NDV)F基因在重组鸡痘病毒(rFPV-F-VP0)第1、5、10、15、20代次中的表达整合情况。结果表明,建立的标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。在线性浓度范围内,随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,0.99<相关系数(r2)<1,0.8<扩增效率(E)<1.2,熔解曲线为单一特征峰型。本试验精确定量了外源基因在重组鸡痘病毒中的表达水平,为阐明重组鸡痘病毒的表达机理提供了理论基础。     

适合猪圆环病毒2型敏感复制的PK15细胞株的克隆与鉴定

为了有效提高猪圆环病毒2型(PCV2)在PK15细胞中增殖的效价,采用有限稀释法将PK15细胞进行克隆,通过间接免疫荧光方法筛选对PCV2敏感的克隆细胞.结果表明,通过克隆后获得1株对PCV2高度易感的细胞PK15-B1,该细胞接种PCV2后培养3 d,病毒的TCID50达10-7.0/mL,病毒效价和生产速度明显高于...     

山羊关节炎-脑炎病毒陕西分离株全基因组的克隆和序列分析

为了解山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)陕西分离株全基因组的特点及基因演化变化,根据Gen-Bank中登录的CAEV CO株的全基因组序列,设计合成了5对引物,对CAEV陕西株的全基因组进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果显示,CAEV陕西株的基因组全长为9 065nt,获得的GenBank登录号为GU120138,包括两端的长末端重复序列,结构蛋白编码基因gag、pol、env和调节蛋白编码基因tat和rev,以及辅助蛋白编码基因vif。核苷酸序列比对表明,CAEV陕西株和CAEV甘肃株的同源性为99.6%,与CAEV CO株的同源性为92.4%,根据全基因组序列和gag基因序列构建的遗传进化分析结果显示,CAEV陕西分离株属于SRLV B2亚型。     

宗教自由基本权利的肥大症——关于宗教和世界观自由与一般权利有效性请求的关系

当人们通览宗教和世界观自由的基本权利在过去十几年里的实际运用和法教义学上的发展时,很难忽略其在规范性轮廓上萎缩这一事实。这一现象由构成要件要素的发展上更多地考虑主观标准所承载,并且经由联邦宪法法院在司法判例中对有关限制问题的决断性的、限制性的判决而被强化。因此,相对于依据宗教或者世界观的动机而提起的个人的发展请求,一般的法治国规范的有效领域持续地受到限制。当相关现象的潜在冲突在德国呈现趋势性增长的时候,这样的判断就显得越发的危险。