猴源环孢子虫的分离与分子鉴定

采用饱和蔗糖漂浮法、改良抗酸染色法和孢子化试验首次从广东某猴场的猴粪中分离到疑似环孢子虫卵囊。为了对其进行分子鉴定,采用巢式PCR和普通PCR方法,针对环孢子虫属18SrDNA和ITS基因设计了3对引物,扩增其目的片段,并进行了序列分析。结果显示,卵囊大小为7.5～10μm,经改良抗酸染色的卵囊染色程度不一,孢子化卵囊内含2个孢子囊,每个孢子囊内含有2个子孢子。通过PCR扩增,获得的18SrDNA目的片段长712bp,测序结果表明该猴源环孢子虫18SrDNA基因与Cyclosporacolobi、狒狒环孢子虫、人环孢子虫的相似率较高,在进化树上位于同一分支。获得的ITS-1+片段长760bp,其中ITS-1序列高度特异,在GenBank中未见同源性序列。结果表明,从猴粪中分离的疑似环孢子虫卵囊应属于环孢子虫。     

犬瘟热病毒昆明分离株的生物学特性

从1只曾接种过犬瘟热弱毒疫苗但又发病的宠物犬血样中分离到1株犬瘟热病毒(CDV),命名为CDV昆明分离株(CDV-KM)。该毒株可使Vero细胞产生以细胞融合及空泡化为特征的细胞病变,病毒效价为105.8TCID50/mL或1.76×106PFU/mL,并能在鸡胚绒毛尿囊膜、鸡胚成纤维细胞及MDCK细胞上增殖。微量中和试验结果发现,自制的犬抗CDV-KM株同份血清对CDV-KM株与参考毒株CDV-Onder-stepoort的中和抗体效价即半数保护量分别为1:142和1:132,显示二者未存在明显的中和表位差异。RT-PCR、RFLP和DNA测序分析结果显示,使用参照组合引物CDV-P2/P3/P4扩增,均可得到被认为指示弱毒株特征的177bp核酸片段;而H蛋白全长基因扩增产物未见能指示野生毒株特征的NdeⅠ和SspⅠ酶切位点;H蛋白基因与Onderstepoort小空斑变异株、鸡胚适应株和大空斑变异株的核酸序列同源性分别为98.84%、98.90%和100%。表明该分离株属于疫苗基因群。     

鼠伤寒沙门氏菌Χ4550 FlhD基因缺失株的构建

为构建鼠伤寒沙门氏菌Χ4550FlhD基因缺失所致的鞭毛缺失株,采用PCR技术从减毒鼠伤寒沙门氏菌Χ4550基因组DNA中扩增出了鞭毛控制操纵子基因(FlhD)两侧翼基因片段,作为FlhD基因敲除所需的上臂和下臂的同源序列;以pKD4质粒为模板,扩增了卡那霉素(Km)抗性基因,并分别克隆入pMD18-T载体中,获得了重组质粒pMD-FlhD-U、pMD-FlhD-D和pMD-Km。将获得的上臂和下臂基因以及卡那霉素抗性基因通过拼接,构建重组质粒pMD-ΔFlhD/Km。将重组片段ΔFlhD/Km亚克隆入pG-MB151自杀质粒,并转化大肠杆菌χ7213,获得重组菌χ7213(pGMB151-ΔFlhD/Km)。将此细菌作为供体菌,与受体菌鼠伤寒沙门氏菌Χ4550进行固相杂交,经同源重组和抗生素筛选,获得鼠伤寒沙门氏菌Χ4550(ΔFlhD/Km)鞭毛缺失株。通过PCR扩增、动力学鉴定及电镜观察,显示鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因已被成功敲除。证实,运用同源重组的方法可成功地敲除鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因,并导致其鞭毛缺失,为鼠伤寒沙门氏菌鞭毛的功能研究奠定基础。     

缺失信号肽和跨膜区的PRRSV GP5融合蛋白基因的表达

通过分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HH08株GP5基因序列,设计了2对引物,经PCR扩增,获得不含信号肽和跨膜功能区的GP5基因片段,长度分别为121 bp和248 bp。应用酶切位点相连构建融合基因技术,将2段基因亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组表达质粒pET-GP5。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得高效表达。免疫印迹试验证实,表达的融合蛋白能与特异性血清抗体反应,表明表达的PRRSV GP5蛋白具有良好的生物学活性。     

鸡马立克氏病肾肿瘤p15基因的甲基化特异性PCR检测

选取300只1日龄公鸡,人工复制鸡马立克氏病(MD)模型,随机分为对照组和MD组,分别于35日龄、40日龄、45日龄采取鸡肾,观察病理组织学变化,通过甲基化特异性PCR方法,检测了MD病鸡肾肿瘤发生和发展过程中p15基因甲基化的变化,以探讨p15基因甲基化与肾肿瘤发生、发展的关系。结果显示,MD组鸡的临床表现以及肾组织的病理变化符合MD的特征,说明人工复制MD模型成功。在正常鸡肾组织中没有发生p15甲基化,在MD病鸡肾组织中p15甲基化的发生率高达61.7%,与正常对照组差异极显著(P0.01),并呈时间效应。证实,p15基因甲基化与MD的发生、发展密切相关。     

牦牛舌抗菌肽基因cDNA的克隆及其在生殖系统中的表达

为了解牦牛舌抗菌肽(LAP)基因序列的特征及其在生殖系统中的表达情况,采用RT-PCR法从牦牛睾丸、附睾组织中扩增LAP基因,重组到pMD19-TSimple载体中,进行了测序和序列分析,并应用RT-PCR检测了雌性牦牛生殖系统(卵巢、输卵管、子宫、阴道等组织)中LAPmRNA的表达。结果显示,克隆的LAP基因包含一195bp的完整开放阅读框(ORF),与牛LAP基因相似性达97.9%,该ORF编码的64个氨基酸含有β-防御素特征性结构,即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基;LAP在牦牛生殖系统上皮组织中均有表达。推测LAP在牦牛生殖系统的先天免疫中具有重要作用。     

重组鸡白细胞介素6对不同种类疫苗的免疫增强作用

为评价重组鸡白细胞介素6(rChIL-6)在商品鸡体内对不同种类疫苗的免疫增强作用,采用不同接种方式,应用rChIL-6分别对不同种类新城疫病毒(NDV)单联疫苗和新城疫病毒-传染性支气管炎病毒-禽流感病毒H9亚型三联疫苗(NDV-IBV-H9)进行了免疫增强试验以及传染性法氏囊病病毒(IBDV)单联油乳剂灭活疫苗的免疫增强田间试验,并进行了将rChIL-6与NDV Ⅳ系预混合乳化制备成的灭活疫苗的免疫试验.结果表明,将rChIL-6与NDVⅣ系、Ⅰ系活疫苗预混合后分别采用滴鼻点眼、肌肉注射接种方式的免疫增强效果优于其他方式;rChIL-6与NDV抗原预混后制备成油乳剂灭活疫苗的免疫增强效果优于将相同抗原量的NDV油乳剂灭活疫苗和rChIL-6同时分点免疫接种.rChIL-6对NDV油乳剂灭活疫苗的免疫增强效果优于活疫苗,对NDV单联灭活疫苗的免疫增强效果优于NDV-IBV-H9三联灭活疫苗.田间试验表明,rChIL-6对IBDV油乳剂灭活疫苗首免和二免都具有显著的免疫增强作用,二免的免疫增强效果优于首免.这些研究结果为进一步开展新型鸡基因工程免疫增强剂研究奠定了基础.     

食品中沙门氏菌DNA环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据沙门氏菌属高度保守的fimY基因序列设计了2对特异性引物,采用环介导等温扩增方法(LAMP)建立了食品中沙门氏菌的LAMP快速检测方法。结果表明,建立的LAMP方法具有高度特异性,经对40种共68株细菌进行扩增,所试32株沙门氏菌均为LAMP阳性,其他菌株为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的沙门氏菌的检测灵敏度为5CFU/管,对污染食品中沙门氏菌的检测灵敏度为9CFU/管,60min内即可完成检测。用建立的LAMP方法对802份肉类、蛋、奶及其制品和动物腹泻物、人工污染样品等进行检测,共检出165份LAMP阳性样本,与国标(GB/T4789.4-2008)方法的检测结果一致。建立的LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

猪瘟病毒NS3蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

以含有猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA的重组质粒pOKShimen为模板,经PCR扩增获得NS3基因,利用原核表达载体pMAL-c2X、pET32a以及杆状病毒表达载体pFastBacH T B表达CSFV石门株NS3基因,获得3种重组蛋白:MBP-NS3、His-NS3和rNS3。Western-blot分析及间接免疫荧光试验证实,这3种不同载体表达的NS3蛋白均能被猪瘟阳性血清所识别。利用直链淀粉树脂柱对重组蛋白MBP-NS3进行纯化后,用其免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接ELISA筛选,获得2株能稳定传代并分泌针对抗CSFVNS3蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为1D10和1H10。Western-blot分析及间接免疫荧光试验结果证明,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均可识别CSFVNS3蛋白。     

鹅细小病毒vp1基因的原核表达及抗原性分析

将鹅细小病毒(GPV)H1株vp1基因从pMD18T-vp1亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1的多克隆位点,构建了原核表达载体pGEX-6P-vp1,将其转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了108ku的融合蛋白,该融合蛋白经亲和层析纯化并经Western-blot检测。结果表明,纯化的融合蛋白可与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。