PowerPlex~ 21试剂盒扩增后的分型图谱中Y片段丢失的识别

目的依据分型图谱,直观、简便识别是否存在Amelogenin基因Y片段丢失的可能。方法采用计算分型图谱中等位基因峰高之和比值的方法,统计1 968份人员样本经Power Plex~ 21试剂盒扩增后Amelogenin与D3S1358基因座之间的均衡性、Amelogenin X等位基因与Amelogenin Y等位基因的均衡性以及D3S1358基因座不同等位基因的均衡性情况。结果 90.8%的女性样本Amelogenin X等位基因峰高不低于D3S1358基因座等位基因峰高和的60%,94.9%的男性样本Amelogenin X等位基因的峰高不超过D3S1358基因座等位基因峰高和的70%。结论 Power Plex~ 21试剂盒扩增后的分型结果中,当Amelogenin基因只检测到Amelogenin X等位基因,且Amelogenin X等位基因的峰高不及D3S1358基因座等位基因峰高之和的70%时,应考虑存在Y片段丢失的可能性。     

大鼠急性肾缺血再灌注损伤早期的基因表达

目的研究急性肾缺血再灌注损伤早期的差异基因表达,探索其潜在的分子机制。方法通过单纯夹闭大鼠肾动脉制备肾缺血再灌注模型,进行基因表达芯片检测和生物信息学分析,筛选急性肾损伤早期的差异基因表达及其所涉及的细胞活动和信号通路。同时,通过构建差异表达基因的生物网络来寻找与急性肾损伤关系密切的分子,并进行荧光定量PCR验证。结果在检测出的151个差异表达基因中,132个基因显著上调,19个基因显著下调,GO与KEGG通路富集分析结果显示主要与细胞增殖、细胞因子介导的信号通路和免疫反应等有关。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,挑选出的3个与急性肾损伤高度相关的基因(ANXA1、PHLDA1、KLF6)在疾病早期具有显著的表达差异,上升倍数与芯片检测出的倍数基本一致。结论本研究揭示了急性肾损伤早期的差异基因表达特征以及所涉及的生物学过程和信号通路,其中ANXA1、PHLDA1、KLF6可能在急性肾损伤的发病机制中起到一定作用。     

劳动改造手段的经济基因抑制与科学发展探索

将劳动改造确立为改造罪犯的基本手段之一,通过劳动将罪犯改造成为守法公民,是我国监狱工作的特色之一。监狱组织罪犯参加劳动不仅产生社会效益,而且产生经济效益,劳动改造手段的这一经济基因,使其易于异化为赚钱手段。因此,监狱既要坚持“劳动”改造罪犯这一中国特色,更应从科学发展的高度对其加以审视．并采取有效的应对措施。     

猪胸膜肺炎放线杆菌半套式PCR检测方法的建立及应用

根据1型胸膜肺炎放线杆菌apx Ⅳ A基因3'端序列设计3条引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的半套式PCR方法.筛选了该方法的最佳反应条件,并采用该方法进行临诊检测,比较了不同处理临床样品的检测结果.结果表明,该方法能检测出所有供试血清型APP,不能从猪上呼吸道常见细菌基因组DNA中扩增出条带,特异性好;最低DNA检出量为16.5 fg,其灵敏性是常规PCR方法的1 000倍;重复性试验结果表明,该方法稳定可靠.应用半套式PCR方法检测临床样品,检出率显著高于细菌分离鉴定;样品保存方法和核酸抽提方法能影响阳性样品的检出率.     

牛趋化因子受体4基因的克隆表达及序列分析

采用RT-PCR技术,从被刺激诱导的牛外周血单个核细胞(PBMC)中克隆了牛趋化因子受体4(CXCR4)全长基因,并将CXCR4基因和CXCR4基因N端1～126 bp(CXCR4~(42aa))片段分别亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,命名为pGEX-4T-1-CXCR4、pGEX-4T-1-CXCR4~(42aa).获得重组菌株后,采用不同的IPTG浓度、不同诱导时间、不同温度和不同培养基等组合诱导表达这两种重组菌,其中pGEX-4T-1-CX-CR4~(42aa)重组菌获得了表达,并在37℃、IPTG浓度为0.8 mmol/L、诱导6 h时表达量最大,约占菌体总蛋白的45%,目的蛋白主要以包涵体的形式存在;而pGEX-4T-1-CXCR4重组菌未表达出目的蛋白.     

东北地区新城疫流行株的分子生物学特性调查

从东北地区发生新城疫 (ND)的病鸡、病鸽和产蛋下降鸡分离到 19株NDV ,对其融合蛋白 (F)基因 5 32bp或 2 80bp片段进行了克隆、测序 (在GenBank中的登录号为AY2 0 86 80～AY2 0 86 98) ,并对各株的F基因序列进行了比较。结果 ,各毒株之间的核苷酸同源性为 83.1%～10 0 % ,氨基酸同源性为 85 .5 %～ 10 0 % ;系统发育进化树分析表明 ,其中 2株与疫苗株V4同属基因Ⅰ型 ,为弱毒株 ;其余 17株为强毒株 ,其中 2株为基因Ⅵ型 ,其余为基因Ⅶ型。表明东北地区目前由 3种基因型的NDV毒株 (Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型 )所引发 ,并以基因Ⅶ型为主。另外 ,对其中的代表毒株APMV1/chicken/China/JL 11/ 0 2进行了免疫学试验 ,结果显示 ,LaSota疫苗的免疫保护效果不理想 ,可能是LaSota疫苗免疫鸡群发生ND的主要原因。     

五种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病痛毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上,以这5种细胞毒的核酸作为模板,进行不对称PCR扩增,制备靶物,经绿色荧光染料Cy3标记后,分别与cDNA微阵列的芯片探针进行杂交,杂交信号经Genepix 4000A扫描仪扫描.结果显示,该芯片探针可以特异地与Cy3标记的这5种靶物结合.用该基因芯片对100份现地采集的猪全血样品进行检测,检出PRRSV阳性样品26份,PCV-2阳性样品47份,PRRSV和PCV-2混合感染阳性样品17份,PPV阳性样品5份,PRV阳性样品2份,CSFV阳性样品20份.表明,本试验研制的cDNA芯片探针可以特异地检测这5种猪病病毒,具有良好的诊断应用前景.     

猪三毛滴虫长春株的形态观察及其5.8 S rRNA基因分析

对从长春地区腹泻仔猪结肠中分离到的1株毛滴虫进行了形态观察,并采用PCR扩增该毛滴虫的5.8SrRNA基因,测序后与国外已报道的三毛滴虫进行核酸同源性分析,并应用DNAStar软件绘制系统发育进化树。形态观察表明分离的毛滴虫为猪三毛滴虫。猪三毛滴虫长春分离株5.8SrRNA序列与国外已报道的三毛滴虫高度同源。系统发育进化树表明该序列与已报道的猪三毛滴虫5.8SrRNA(序列号U85966.1),牛胎儿三毛滴虫5.8SrRNA(序列号U85967.1,AF339736.1,AF466749.1,AF466750.1,AF466751.1)和T.mobiliensis5.8SrRNA(序列号U86612.1)同属于一个亚群,但与另1株猪三毛滴虫5.8SrRNA(序列号AY349190.1)亲缘关系较远。形态观察和5.8SrRNA基因分析表明,从长春地区分离的猪毛滴虫为猪三毛滴虫。     

鸡柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株3-1E基因的重组表达及其表达产物的免疫保护性

应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株子孢子表面抗原3-1E基因,再克隆至质粒载体pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-3-1E,采用EcoR I+Hind III双酶切法及PCR扩增鉴定正确后,将3-1E基因cDNA目的片段亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-32a-3-1E,用EcoR I+Hind III双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确.表达蛋白的SDS-PAGE分析表明,表达产物与预期大小(36.47 ku)一致,为可溶性表达.对诱导时间以及IPTG浓度的优化结果表明,当诱导6 h且IPTG浓度在0.8 mmol/L时表达量最大.Western-blot分析表明,表达的蛋白可被感染柔嫩艾美耳球虫鸡的阳性血清特异性识别.将重组3-1E蛋白纯化后分为肌注蛋白组和肌注蛋白加弗氏完全佐剂组免疫AA鸡,通过计算抗球虫指数检测其保护力.结果显示,肌注重组蛋白组与肌注重组蛋白加弗氏完全佐剂组均能刺激鸡体产生一定的免疫反应,对柔嫩艾美耳球虫感染产生有力的保护,其中后者优于前者,表明该重组3-1E蛋白具有研制成亚单位疫苗的潜力.     

牛分枝杆菌mpb64和Ag85B融合基因在大肠埃希氏菌中的原核表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得mpb64和Ag85B两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)剪接mpb64和Ag85B,得到融合基因mpb64-Ag85B;将融合基因片段先克隆于pMD 18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a( )中,得到重组质粒pET64-85。该重组质粒经核苷酸序列测定,显示其中的外源片段与期望的序列一致;其BL21(DE3)转化菌经IPTG诱导表达带有6个组氨酸标签的融合蛋白;用Ni2 螯合层析方法纯化融合蛋白,Western-blotting分析结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。