Identification of Protected Avian Species Using a Single Feather Barb*,†

Abstract: We report on the unambiguous identification of protected avian species from as little as one barb of a feather. Many avian species are protected by international agreements and national legislation, yet they are traded illegally because of their high value. Two sections of the avian mitochondrial genome were chosen to identify bird species, being a 561‐bp section of ND2 gene and a 921‐bp section of the ND5 gene. Two different DNA extraction methods were compared for their ability to reliably isolate sufficient DNA to be detected in a subsequent PCR. Using a commercial kit supplied by QIAGEN, a complete sequence was obtained from one barb for the ND2 gene, whereas two barbs were required to reliably sequence the 921‐bp section of the ND5 gene. The process worked on all species tested using feathers from archival museum specimens, resulted in minimal damage to the specimen and can readily be adopted by a forensic science laboratory.     

丝状霉形体山羊亚种血清抗体间接ELISA检测方法的建立

利用丝状霉形体山羊亚种标准株PG3制备抗原,经纯化后作为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于检测丝状霉形体山羊亚种血清抗体。经方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为1.09μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物的最佳稀释度为1∶40 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h。判定标准为样品D490 nm值与标准阴性血清D490 nm值之比(P/N)≥3为阳性,≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑。重复性和稳定性试验证明,建立的间接ELISA的稳定性和重复性良好,与间接血凝试验相比,其敏感性较高。     

禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

为了能快速准确地对禽流感进行病原学诊断,根据流感病毒的M基因序列,在保守区内用Oligo4.0软件设计了1对引物,建立了一步法RT-PCR诊断方法,其目的片段大小为229 bp。通过对不同稀释倍数的H5亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,结果显示,病毒尿囊液的最低检出稀释度为1∶104;阳性棉拭子的最低检出稀释度为1∶23。用病毒分离法和一步法RT-PCR同时检测人工感染鸡不同脏器、口咽及泄殖腔棉拭子样品,二者符合率为100%,但前者的检测灵敏度比后者高10~100倍。用该方法检测H1~H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,所有禽流感病毒均有229 bp的目的条带出现,而其他14种禽病病原均无目的条带出现,表明该方法的特异性好。     

禽呼肠孤病毒鸡源分离株的鉴定与人工感染试验

从临床患病鸡关节病料中分离到一株病毒,在电镜下观察到病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,外衣壳直径约75 nm,内核约50 nm;分离病毒株对酸、热有较强的抵抗力,对乙醚不敏感;病毒感染鸡胚成纤维细胞上能产生以融合细胞为特征的CPE;爪垫接种1日龄雏鸡表现出明显的病毒性关节炎临床症状,并伴有吸收障碍型和坏死型的病理变化;血清中和交叉试验表明,该病毒分离株与国内的2株番鸭源呼肠孤病毒(YH和YB)分离株和国外S1133呈不同程度的交叉反应。通过对分离病毒株进行电镜观察、理化特性试验、病毒感染力测定、致病性试验、血清学试验,可以确定该分离病毒为禽呼肠孤病毒。     

禽流感病毒A/Turkey/Canada/63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp,编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示,该毒株HA基因属于H6亚型,NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析,表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80.5%～87.3%,氨基酸的同源性为88.0%～93.1%；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86.0%～93.5%,氨基酸的同源性为90.6%～96.3%。     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

鸡肿瘤病快速鉴别诊断试剂盒的研制及其应用

建立了快速鉴别诊断鸡肿瘤病的PCR技术 ,研制鸡肿瘤病快速鉴别诊断试剂盒。应用该试剂盒在两年多时间里 ,对来源于广西养鸡业发达地区的 13 9个鸡群共 5 0 5只病、死鸡的 15 70份肿瘤及可疑肿瘤组织病料进行了检测 ,马立克氏病、网状内皮增生症和禽白血病的阳性率分别为 74.0 6%、11.49%和 6.73 % ,肿瘤病的混合发生率为 16.83 %。结果表明 ,应用PCR技术建立的鸡肿瘤病快速鉴别诊断试剂盒具有操作简便快捷、结果准确可靠、保存方便等特点 ,不仅适用于临床肿瘤病的鉴别诊断 ,而且对开展肿瘤病的流行病学调查及兽医检疫具有重要意义     

禽流感病毒GD/1/96株M基因在sf9昆虫细胞中的表达

从pUCM 1质粒中亚克隆禽流感病毒M基因至转移载体 pFastBac1质粒 ,PCR鉴定后 ,转化DH10 BAC感受态细胞。提取重组杆粒rBacM ,以M 13为通用引物作PCR分析 ,证明M基因已转入其中。用CellFectin试剂包裹rBacM杆粒转染sf9细胞 ,96h收取感染细胞。细胞表达产物裂解后作SDS PAGE蛋白电泳和Westernblot分析 ,证明M基因在昆虫细胞中成功表达且具有与天然M 1蛋白相似的活性。琼脂扩散试验结果进一步证明 ,重组M 1蛋白可作为诊断抗原。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因真核表达载体的构建

应用限制性内切酶BamHⅠ将片段ompH从重组质粒pMDT-omp H切下,非定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定,证实成功构建了禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因的重组真核表达质粒pcDNA3-ompH。将重组表达质粒转染至 COS7 细胞,经RT-PCR、SDS-PAGE及Western-blotting检测,证明了外膜蛋白H基因获得了瞬时表达。     

禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷贝重组转化子及筛选His Mut 表型转化子后 ,摇瓶培养 ,10mL/L甲醇诱导表达后 ,经SDS PAGE、Western blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明 ,获得了几株高效表达重组表达株 ,并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。