禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷贝重组转化子及筛选His Mut 表型转化子后 ,摇瓶培养 ,10mL/L甲醇诱导表达后 ,经SDS PAGE、Western blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明 ,获得了几株高效表达重组表达株 ,并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。     

论生物基因的法律保护

本文从当前世界对生物基因的法律保护及存在的主要问题着手 ,分析我国对生物基因法律保护中存在的几个问题 ,并提出制订一部适合中国国情的生物基因法律保护制度中必须注意的几个问题     

两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2,并对其进行了测序与分析。结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97.3%~99.9%,与PCV2 ORF2基因的同源性为67.9%~68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明,PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒(NDV)强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V 基因全长cDNA,并引进相应的突变位点,将其克隆到pMD18-T载体,然后亚克隆到原核表达载体 pET-30c上,重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,筛选出阳性重组质粒,并命名为pET-30c-V。将 pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol／L IPTG 37℃过夜诱导表达,SDS-PAGE 及Western-blotting分析结果表明,所表达的NDV V重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子质量约28 ku,与理论值大小相符。将包涵体用8 mol／L脲变性,经Ni-NTA柱纯化,透析复性,得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡(300 μg／只),成功制备了抗鸡NDV V蛋白的抗血清。     

猪和野生动物源大肠杆菌及沙门菌中磺胺类药物耐药基因的检测

对从四川省10个规模化猪场和16种野生动物的粪样中分离鉴定出的67株大肠杆菌、57株沙门菌进行了药敏试验。结果,猪源和野生动物源分离菌对磺胺类药物的耐药率分别为72.0%(72/100)和29.2%(7/24)。根据GenBank中登录的序列,设计了3对特异性引物,对磺胺类药物的耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行了三重PCR检测。在这124株细菌中,Sul1基因的检出率最高,为47.6%(59/124),Sul2基因的检出率为17.7%(22/124),Sul3基因的检出率为18.5%(23/124)。药敏试验结果与基因检测结果的符合率为89.9%。     

鸡抗病毒Mx基因的克隆与序列分析

用干扰素诱导剂poly(I)/(C)诱导鸡胚成纤维细胞,提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增了北京白鸡Mx基因全长编码区序列.序列分析表明该基因编码区长2118 bp,编码705个氨基酸残基,其第631位为天冬酰胺,理论上推测具有抗病毒活性.通过与GenBank中已登录的7个品系鸡Mx基因进行核苷酸系统进化树分析,结果显示,北京白鸡Mx基因与WL-N品系鸡Mx基因的亲缘关系最近.北京白鸡Mx基因序列与其他动物Mx基因序列的比较结果显示,核苷酸同源性为49.5%～76.8%,氨基酸同源性为44.1%～61.6%.据此可以推断克隆的Mx基因具有抗病毒活性的分子特征和特征性功能结构,不同种属动物Mx基因的同源性与其亲缘关系呈正相关.     

产气荚膜梭菌贵州分离株α-毒素基因的克隆与鉴定

提取了A型产气荚膜梭菌贵州分离株的染色体DNA,经聚合酶链反应(PCR)扩增并回收获得了1条242bp的特异性片段,将该基因片段克隆到质粒载体pUC19中,并转化至大肠埃希氏菌JM109中;经氨苄青霉素(Amp)抗药性和显色反应筛选及重组质粒酶切分析、PCR鉴定和Southern blotting检测,表明该重组质粒是产气荚膜梭菌α 毒素基因的克隆。     

食蟹猴源食道口线虫和缩小特尼登线虫的形态学鉴定及基于其ITS2基因的分子种系发育分析

对采集自食蟹猴肠道血结节中的3种线虫进行形态观察后鉴定,并用PCR扩增其ITS2基因后进行序列测定分析。结果显示,3种线虫分别为尖形食道口线虫、双叉食道口线虫及缩小特尼登线虫。测序结果表明,3种虫体ITS2基因序列的大小均为216bp。邻位连接法构建的种系发育树显示,本研究中测定的尖形食道口线虫、双叉食道口线虫和缩小特尼登线虫序列在进化树上自成独立的拓扑分支。以上结果为人类食道口线虫病及缩小特尼登线虫病建立分子鉴别诊断方法提供了分子标记。     

H3N8亚型马流感病毒VLPs的构建及其生物学特性分析

为了构建含H3N8亚型马流感病毒HA蛋白和M1蛋白的病毒样颗粒疫苗,把A/equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)的HA基因和M1基因克隆到杆状病毒穿梭载体pFastBac Dual中,将得到的重组穿梭质粒pFBD-XJ3HA-M1转化至DH10Bac感受态细胞,与杆状病毒骨架质粒Bacmid进行重组从而获得重组杆状病毒转座子rBac-XJ3HA-M1,然后将其转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBV-XJ3HA-M1。通过PCR鉴定、细胞免疫组织化学试验、Western-blot分析以及血凝试验证明,HA蛋白和M1蛋白在昆虫细胞中能够有效表达,且表达产物具有良好的反应活性,表达的HA蛋白具有血凝活性。电镜观察发现,HA蛋白和M1蛋白能够稳定形成病毒样颗粒。上述研究结果为研制马流感亚单位疫苗提供了技术储备,也为马流感病毒蛋白的功能研究奠定了基础。     

小型猪复合麻醉剂及赛拉嗪对大鼠大脑皮层与小脑c-fos基因表达的影响

为研究小型猪复合麻醉剂(XFM)及赛拉嗪对大鼠大脑皮层与小脑c-fos基因表达的影响,将114只SD大鼠随机分为空白对照组(B组)、生理盐水对照组(C组)、XFM麻醉组(H组)和赛拉嗪组(X组)。除B组外,各组又分为6个亚组:麻醉诱导期(Ⅰ期)、翻正反射消失(Ⅱ期)、翻正反射消失后15min(Ⅲ期)、翻正反射消失后35min(Ⅳ期)、翻正反射恢复(Ⅴ期)、恢复直线爬行(Ⅵ期)。各组大鼠在对应的时间点断头处死,分离并采集大脑皮层和小脑,并分别提取RNA和蛋白质,用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测各样品中c-fos基因mRNA含量和蛋白含量。结果显示:(1)C组大鼠大脑皮层与小脑c-fos基因的表达无显著变化(P0.05);(2)H组这2个脑区c-fos基因mRNA转录量逐渐升高,在Ⅲ期达到最高(P0.01),在麻醉苏醒过程中下调;c-fos蛋白在麻醉过程中表达量上调,在麻醉苏醒后(Ⅵ期)表达量下降(P0.01);(3)X组上述脑区c-fos基因mRNA表达量上升,主要在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期明显升高(P0.01),Ⅵ期下降至接近对照组水平;c-fos蛋白表达逐渐升高,而在Ⅴ、Ⅵ期表达下降(P0.01),X组c-fos表达水平较H组表达水平低(P0.01)。结果提示:在XFM和赛拉嗪麻醉过程中,大鼠大脑皮层与小脑中c-fos基因的表达量随麻醉加深而增加,在麻醉苏醒过程中表达量下降,大脑皮层及小脑可能是XFM和赛拉嗪的麻醉作用位点,两种药物对大鼠大脑皮层与小脑内c-fos基因表达的影响可能是其麻醉作用机制之一。