应用PCR检测成年鸭体内鸭瘟强毒的分布

鸭瘟病毒 (DPV)强毒经人工接种和同居感染 10 0日龄鸭后 ,应用聚合酶链反应 (PCR)检测病毒在鸭体内各组织器官的动态分布。试验结果表明 ,DPV强毒经肌肉注射进入鸭体后 6h可在肝、脾、血液和粪便中检测到DPVDNA ;DPV强毒经肌肉注射到鸭体后各受检样品被检测到DPVDNA的先后顺序为 :肝、脾、血液和直肠粪便 (6h)→肺、脑和腿肌 (12h)→肾和胸肌 (2 4h) ;同居鸭于混群后 4 8h在肝、肺、血液和直肠粪便中检出DPVDNA ;DPV强毒经同居感染鸭后各受检样品检测到DPVDNA的先后顺序为 :肝、肺、血液和直肠粪便 (48h)→脾和脑 (72h)→胸肌和腿肌 (96h)→肾 (12 0h)。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白Erns的表位分析及其单克隆抗体轻链可变区cDNA的测序

应用抗CSFVAlfortT櫣ｂｉｎｇｅｎ毒株Ｅｒｎｓ结构蛋白的ｂ4 2 2、2 4 / 16单克隆抗体 ,筛选了噬菌体展示的 12肽随机肽库 ,进行了Erns结构蛋白表位分析。研究发现 ,b4 2 2、2 4 / 16单克隆抗体识别的表 (拟 )位基序分别为DKNR(Q)G、A(T)CxYxKN ,定位于Erns结构蛋白的 384～ 386及 32 2～32 3位、380～ 386位氨基酸区域。二者识别的表 (拟 )位基序存在共有序列KN ,针对的是Erns蛋白中的相似抗原区 ,但其拟位的侧翼序列及ELISA、免疫印迹分析结果均存在差异。自杂交瘤细胞中提取总RNA ,对单克隆抗体轻链可变区cDNA进行了测序。结果证实 ,b4 2 2、2 4 / 16单克隆抗体虽然来源于同一批次融合的杂交瘤细胞系 ,识别相似抗原区 ,但属于不同的单克隆抗体     

尤凯帕病毒HN基因的克隆与原核表达

通过提取尤凯帕病毒 (Yucaipavirus ,PMV 2 )的RNA ,进行RT PCR ,获得了HN基因。序列分析结果表明 ,HN基因的ORF全长为 174 3nt,编码一由 5 80个氨基酸组成的蛋白。HN基因经双酶切后连接入 pTYB 2原核表达载体。酶切鉴定筛选阳性克隆 ,用IPTG诱导表达 ,经SDS PAGE电泳和Western blotting检测均可见一约 110ku的目的条带 ,说明大肠埃希氏菌表达的HN蛋白能与抗PMV 2阳性血清特异性结合。     

抗兔出血症病毒单克隆抗体的制备

用1∶10稀释的兔出血症病毒(RHDV)加等量佐剂乳化后接种BALB/C小鼠3次,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。通过用间接ELISA试验筛选、克隆出分泌抗RHDV单克隆抗体的杂交瘤细胞林E_3E_6。     

牛病毒性腹泻病毒三种核酸检测方法的比较

利用针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的常规RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)和RT-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)3种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行了检测,以比较3种核酸检测方法的优越性。结果显示,3种核酸检测方法中,real-time RT-PCR和RT-LAMP一样敏感,均能检测到10拷贝/μL,常规RT-PCR只能检测到1×104拷贝/μL,但临床样品检测表明,常规RT-PCR方法敏感度低,会造成一部分漏检,RT-LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较3种方法后,推荐用RT-LAMP结合real-time RT-PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛病毒性腹泻的检出率。     

认识法医学中的AIDS

获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmune deficiency syndrome,AIDS),又称爱滋病,其发病率呈逐渐上升趋势,尤其在需要法医病理学鉴定的尸体中所占的比例可能更高.其流行病学研究业已取得较大进展.法医如何认识爱滋病,在实践检案中如何加强自我保护,在国外法医同道中有一些成熟的理论和操作方法;但在国内法医学界,对这些问题的认识尚有差距.作者从国内外刊物上摘录有关内容加以整理,从流行病学、临床学、鉴定学及鉴定中的防范措施等方面入手,目的在于引起法医学界对爱滋病的重视,避免对该类案例的误鉴,拜促进防范措施的建立,以利于自我保护.     

鸭瘟病毒gC基因的克隆及其分子特性分析

对已构建的鸭瘟病毒(DPV)DNA文库重组质粒测序后,运用ORF Finder、BLASTN等工具进行全面生物信息学分析,根据分析结果设计引物,以DPV DNA为模板进行PCR扩增和T克隆,获得完整基因,经测序和探针核酸斑点杂交进行验证。结果证实,获得的完整ORF片段(ORF1296)为DPV的gC基因(GenBank登录号EU076811),全长1 296 bp,与已报道的其他疱疹病毒gC基因具有较高的同源性,它编码432个氨基酸,蛋白分子质量为45 ku、等电点(PI)为5.292,具有疱疹病毒典型I型膜蛋白结构特征。gC基因进化树分析表明,DPV与α-疱疹病毒亚科的鸟源疱疹病毒亲缘关系最近,编码的gC蛋白多为柔性区域,富含无规卷曲,含少量α-螺旋和β-折叠,氨基酸序列的第21～24、50～58、67～70、161～171、273～281、387～393位最有可能为抗原表位。此结果为进一步开展DPV gC基因及其编码蛋白的深入研究提供了有用数据。     

新城疫疫苗毒与野毒的区别诊断及其多功能检测软件的开发

运用生物信息学软件对GenBank中收录的30株新城疫病毒(NDV)全基因组序列间的差异和它们对应的F基因片段22～420核苷酸序列间的差异进行了分析。发现这些差异高度相关(r=0.937),该片段可作为区分NDV野毒和疫苗毒的指纹序列。据此设计了1对扩增用简并引物(其中一条用于PCR产物的直接测序),建立了RT-PCR-测序技术,并测得2个参数:NDV标准疫苗指纹序列库和指纹序列的变异参数。在此基础上,开发出多功能自动分析软件,通过对该指纹序列的分析,不仅可以区分NDV疫苗毒和野毒,还能同步测定这些病毒的毒力和基因型。该技术对NDV标准毒株的测定结果与已知信息完全吻合,且只需3 d即可获得结果。对不同禽类(鹅、鸽、鸵鸟、鸡)中分离的NDV的测定结果表明,59%为残留的疫苗毒。     

泛亚型口蹄疫病毒O/China/99缺失毒株全长cDNA分子克隆的构建

设计并合成了4条O型口蹄疫病毒(FMDV)泛亚型代表毒株O/China/99基因组的引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连接到pOK12载体上,然后人工合成一段缺失PKs的5′UTR序列,利用两端的限制性内切酶位点,将该基因片段插入到上述载体中。酶切、PCR和序列测定结果显示,O/China/99株全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的核苷酸序列同源性为99.1%。结果表明,O/China/99缺失毒株全长cDNA分子克隆的构建成功。     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的表达及纯化

用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Zhejiang/12/00中获得NA基因,将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a中,将序列测定和双酶切验证准确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导,经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,重组蛋白得到了可溶性表达,表达的蛋白质分子质量为33 ku;该蛋白可以与禽流感H5N1亚型阳性血清反应,具有良好的免疫原性;ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。