枯草芽孢杆菌pgsA与猪传染性胃肠炎病毒Sa融合基因的原核表达

为利用原核表达方法使猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Sa蛋白表达在细菌的外表面,对克隆载体pMD18-T-pgsA进行KpnⅠ+BamHⅠ双酶切,将所得片段插入表达载体pET-32a(+)中,构建了重组质粒pET-pgsA,对克隆载体pMD18-T-Sa和重组质粒pET-pgsA分别进行BamHⅠ+HindⅢ双酶切,将Sa片段插入pET-pgsA中,构建重组质粒pET-pgsA-Sa。重组质粒pET-pgsA-Sa经PCR和序列鉴定为阳性后,转化入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,在70ku处出现了与预期大小相符的目的条带。Western-blot试验证实,融合基因pgsA-Sa获得了正确表达,具有良好的反应原性。间接免疫荧光试验证实融合蛋白在大肠杆菌表面获得了表达。结果表明,成功实现了TGEV Sa蛋白在细菌外表面的正确表达,初步鉴定其具有良好的反应原性。本研究为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪瘟病毒复合多表位抗原基因的克隆表达及其免疫学特性

为研究猪瘟病毒多表位疫苗,参照GenBank及文献中已发表的猪瘟病毒抗原表位,结合计算机分析软件进行优化和组合。将重组的多表位基因BT23人工合成克隆至pMD18-T质粒中,利用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切并回收BT23基因,将BT23基因片段亚克隆插入pGEX-6P-1表达载体中,构建了猪瘟病毒复合多表位抗原基因的原核表达质粒pGEX-BT23,经酶切和测序鉴定正确后转化感受态细胞BL21(DE3),并进行了IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,以终浓度为0.9mmol/L的IPTG进行诱导,8h后表达量最高,表达产物为融合蛋白,并且以包涵体形式存在,分子质量约36ku,表达产量约占菌体总蛋白的30%。Western-blot检测结果表明,表达的融合蛋白能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,说明表达产物具有良好的反应原性。免疫攻毒试验结果表明,复合多表位融合蛋白具有免疫保护作用,这为应用该融合蛋白制备猪瘟病毒免疫血清学诊断试剂和多表位疫苗的研究奠定了基础。     

2004-2010年浙江省及其周边地区PRRSV GP5基因的分子进化与变异分析

用RT-PCR方法对分离自浙江省及其周边地区部分猪场的50个猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株和3个疫苗毒株的GP5基因进行了扩增、克隆和序列分析,并与国内外的代表性毒株进行了序列比对。结果表明,2004-2010年检测的PRRSV毒株均属于美洲型,大部分毒株属于亚群1,各毒株间的核苷酸和氨基酸同源性分别在81.6%～100%和72.1%～99.5%之间,浙江省及其周边地区亚群1毒株与我国最早分离到的美洲型毒株CH-1a的核苷酸和氨基酸同源性分别为84.5%～95.7%和78.6%～95.0%,与疫苗株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为88.1%～99.2%和85.4%～99.0%。糖基化位点以及抗原表位都有一定程度上的变异。     

猪源乙型脑炎病毒HEN0701株全基因组的分子特征

将乙型脑炎病毒HEN0701株基因组RNA分4段进行RT-PCR扩增,并克隆入pCRⅡ-Blunt-TOPO载体中,测定全长cDNA序列。以MapDraw软件分析了乙型脑炎病毒HEN0701株的基因组结构,并将病毒基因组分成2个非编码区和10个基因,比较了HEN0701株和11株乙型脑炎病毒在全基因组和各基因的核苷酸及推导氨基酸的同源性。以MEGA5软件绘制HEN0701株和11株病毒C、E、NS3、NS5基因的进化树。结果显示,HEN0701株全基因组为10 965 nt,包含一长10 299 nt的开放阅读框。在核苷酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株的全基因组和各基因的同源性均高,而与GⅢ分离株则较低;而在氨基酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株在多聚蛋白和各病毒蛋白的同源性和HEN0701株与GⅢ分离株的相近。进化分析显示,不同基因进化树的拓扑结构相近,12株病毒的C、E、NS3、NS5基因进化方向相同,GⅠ分离株和GⅢ分离株间C基因进化距离最近。     

猪瘟病毒浙江分离株体外生长特性及其囊膜糖蛋白E2分子的变异分析

为了研究分离于浙江省衢州和杭州的2株猪瘟病毒基因2型流行毒株QZ-07、HZ1-08在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)中的生长特性及其囊膜糖蛋白E2的分子进化特征,采用间接免疫荧光、效价测定和进化分析等分子生物学方法将基因2型流行毒株与基因1型石门株进行了比较。结果表明,石门株在PK-15细胞中的增殖效率明显高于ST细胞;感染PK-15细胞后第48小时,细胞内的效价可达107TCID50/mL,而在ST细胞中的效价只有105.25 TCID50/mL。基因2型毒株在PK-15细胞中的增殖水平明显低于ST细胞,尤其以HZ1-08株更为明显;感染ST细胞后第48小时,细胞内的效价为105 TCID50/mL,而PK-15细胞中的效价只有102.75 TCID50/mL。两基因型毒株E2的核苷酸同源性低于90%,氨基酸同源性约为90%。表明,基因2型毒株的体外生长特性及其E2的分子特性均与基因1型毒株存在差异。     

猪传染性胃肠炎病毒的血凝作用

将猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）Ａ株在ＩＢＲＳ２细胞上增殖，培养物经差速离心浓缩后与鸡红细胞出现了高凝集价（２８），这种凝集作用能被兔抗ＴＧＥＶ高免血清所抑制。试验的最适反应条件为体积分数０．５０％红细胞４℃作用１ｈ。通过反复试验，建立了一种简单实用的血凝抗原制备方法，病毒培养液不需浓缩可直接应用。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒感染雏鸡免疫器官的病理学观察

应用组织病理学及超微病理学观察手段对H5N1亚型禽流感毒株感染雏鸡免疫器官的病理学变化进行了系统研究。结果显示,感染雏鸡胸腺、腔上囊及脾均表现不同程度的病理学损伤。表明,禽流感病毒感染可造成雏鸡免疫器官组织损伤,这是导致感染雏鸡免疫功能降低的重要机制之一。     

鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯鸭肠炎病毒 (DEV)鸭胚成纤维细胞适应毒 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经间接ELISA筛选 ,有限稀释法 3次克隆 ,获得了 2株稳定分泌DEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1B6和 2G8。经鉴定 ,2株单克隆抗体分别为IgM和IgG1 亚类 ,腹水ELISA效价均达到 1∶1 0 7以上。以 2G8单抗腹水为材料 ,采用间接免疫荧光抗体技术对DEV标准毒感染的鸭胚成纤维细胞进行检测 ,结果表明 ,用该抗体可特异性检出接毒后 6h感染细胞中的DEV ,且感染后 4 8h免疫荧光强度最高 ,该单抗与细胞成分和鸭肝炎病毒无交叉反应。将杂交瘤细胞冻存 3和 6个月 ,复苏后仍能稳定分泌单克隆抗体     

FMDV全ORF编码基因的克隆及其腺病毒穿梭质粒的构建

为研制FMD复制缺陷型腺病毒活载体疫苗,通过RT-PCR方法获得了O型口蹄疫病毒(FMDV)全开放阅读框(ORF)基因片段,将其克隆到pMD18-T载体后测序,再将ORF编码基因定向克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建了重组腺病毒穿梭质粒。经PCR、酶切及测序鉴定,所克隆的ORF编码基因序列与原始强毒株Akesu/58的ORF编码基因比较,L、P1、P2、P3基因的核苷酸同源性分别为98.8%、97.9%、99.0%和97.6%,PCR、酶切鉴定重组腺病毒穿梭质粒均获得了长约6.9 kb的目的基因片段。表明,成功获得了含有O型FMDV全ORF编码基因的阳性克隆,并成功构建了含有完整FMDV开放阅读框架的编码基因表达盒的重组腺病毒穿梭质粒。     

狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因在大肠埃希氏菌中的高效表达

为获得狂犬病病毒(RV)糖蛋白抗原,采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了编码RV糖蛋白的全长基因,将其克隆于pMD18-T载体,再经PCR扩增出糖蛋白全长基因和膜外区基因,将其分别亚克隆至原核表达载体pET-28a( )、pET-32a( )和pGEX-4T-1中,经PCR 和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21 (DE3)中进行表达,结果显示,克隆到pET-32a( )的糖蛋白膜外区基因表达量最高,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45．4％。经Western-blotting检测,不同载体表达的糖蛋白膜外区产物均可与兔抗RV多抗发生特异性反应,表明,重组蛋白具有良好的反应原性。