H5N1型禽流感病毒感染致死的病理组织学改变——附1例尸检报告

本文报导1例经病毒血清学检验确诊为H5N1型禽流感病毒感染致死的尸体，其病理学改变主要特征为肺泡腔面形成厚层均质红染物，肺泡间隔增宽，内有炎细胞浸润。我们认为其肺部组织学改变可以为H5N1型禽流感病毒感染致死的法医学鉴定提供佐证。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎W93株活疫苗的研究及其S1基因的克隆与序列测定

利用鸡胚分离法由发生肾病变型传染性支气管炎 (IB)的病鸡分离到嗜肾型传染性支气管炎病毒 (NIBV)W株 ;再通过SPF鸡胚连续传代 ,获得了NIBV疫苗毒株W93;继而借助RT PCR法扩增了其S1基因 ,并测定了S1基因的核苷酸序列 ,分析了与相关毒株间的同源性。结果显示 ,W93株在鸡胚中的病毒产量达 10 7.8EID50 /0 .1mL ,适用于所有日龄的雏鸡 ;W93S1基因的核苷酸序列与马萨诸塞型的M4 1株、H52 株和H12 0 株的同源性很高 ,分别为 96 .9%、96 .8%和 97.1%。表明 ,W93可作为制备IB弱毒疫苗的毒株     

禽腺联病毒序列对鸡输卵管细胞表达人溶菌酶基因的促进作用

将鸡卵清蛋白基因5′-调控区控制的人溶菌酶(hLYZ)cDNA表达盒插入禽AAV末端反向重复序列之间,将CMV启动子控制的rep表达盒插入其下游,获得的表达载体pRep2ITR-OV4-LYZ用聚乙烯亚胺包裹,经翅静脉注射产蛋鸡,待蛋清中rhLYZ表达水平下降至注射前水平时,用pRep2ITR-OV4-LYZ进行3次重复注射,以RBB-R染料标记比色法和Western-blotting检测蛋清中rhLYZ表达,以细菌生长抑制试验检测rhLYZ活性。结果,在相同试验条件下,pRep2ITR-OV4-LYZ表达rhLYZ的水平和时间优于不含禽AAV序列的pOV4-LYZ,rhLYZ表达水平和时间随载体注射次数增加呈上升和延长趋势,rhLYZ的分子质量与天然hLYZ相同,对致乳牛乳腺炎大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌具有显著的抑制作用。试验结果提示,禽AAV ITR和rep序列能促进hLYZ基因在鸡输卵管细胞中正确表达。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物,以重组pMD-T-VP1阳性质粒为模板,扩增获得了VP1基因,通过酶切将其克隆至表达载体pQE-Trisystem上。经测序证实,重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE-VP1转化至大肠埃希氏菌M15,通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达,SDS- PAGE和Western-blot分析表明,表达产物大小与预期的结果(26 ku)一致,且具有良好的反应原性。以2 mmol／L IPTG诱导表达5 h时表达量最高,其中70％-80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中,表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

口蹄疫病毒整联蛋白受体的研究进展

从组织分布、各毒株利用率、配体结合区介导感染的能力及β亚基胞质区作用等方面论述了4种整联蛋白ανβ1、ανβ3、ανβ6和ανβ8的研究进展,旨在阐明各整联蛋白决定口蹄疫病毒宿主组织嗜性的作用,并为口蹄疫病毒致病机制的研究提供理论依据。     

应用PCR检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒

设计合成了 1对引物 ,建立用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒的PCR方法。结果表明 ,PCR对羊接触传染性脓疱性皮炎病毒细胞培养毒的检测与细胞培养CPE、电镜检测的结果相一致。经对扩增产物进行序列分析 ,与已报道NZ 2株的核苷酸序列同源性高达 97%。用此PCR方法扩增羊痘病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒 ,结果均为阴性。此方法用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒是可行的、特异的     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T-HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒(AIV)HA1基因,并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1,与线性化杆状病毒DNA(Bac-N-BlueDNA)共转染sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经3次蚀斑纯化,得到重组杆状病毒rpBlueHisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示,HA1在昆虫细胞中得到表达,且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明,重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明,重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

O型口蹄疫病毒OA58株3C基因的克隆与真核表达

利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640 bp的口蹄疫病毒目的基因,回收片段后与pMD18-T载体进行连接,测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoⅠ双酶切后,进行定向亚克隆,对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒所含的3C基因读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞,荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光;对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定,证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。     

屠宰猪肝和血清中乙型肝炎病毒及戊型肝炎病毒的检测

应用1对乙型肝炎病毒(HBV)S基因保守区的引物,采用PCR方法从屠宰猪肝、血清中检测到了HBV,序列分析表明,扩增片段与已发表的HBV S基因的同源性高达98%~100%。电镜负染色样品观察结果表明,在HBV表面抗原ELISA检测强阳性反应的血清样品中存在有形态、大小与人HBV Dane颗粒和小球状颗粒相似的病毒粒子。针对戊型肝炎病毒(HEV)ORF2/ORF3重叠区设计了简并引物,采用巢式RT-PCR对屠宰猪肝和血清样品进行了检测。结果表明,部分屠宰猪肝中存在HEV。     

禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR检测技术的建立

研究建立了禽流感病毒(AIV)A型、H5、N1、H9、N2亚型特异性RT-PCR及H5/N1、H9/N2、A/H5/N1多重RT-PCR检测技术,用于检测或同时检测和鉴别A型及H5N1、H9N2亚型AIV。所建立的RT-PCR和多重RT-PCR从核酸提取、基因扩增到产物分析在3~4h内即可完成,经对36株AIV及相关病毒分离物检测,与病毒分离鉴定的结果完全一致,且与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用多重RT-PCR检测80份棉拭子样品,并与病毒分离鉴定方法比较,二者H5N1、H9N2亚型的鉴定结果完全吻合。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为临诊样品中AIV型及H5N1、H9N2亚型鉴定和诊断的有效方法。