基因技术利用行为的刑法规制

基因技术利用行为在给人类社会带来福祉的同时,也引发了一系列伦理和安全问题,需要刑法对之加以回应。现有刑法对基因技术利用行为规制的不足主要有两方面原因：一是我国的刑事立法具有滞后性,并在生物科技利用行为规制方面呈现被动性特点;二是现有罪名存在一定的局限性,虽然我国刑法已经设立了非法植入基因编辑、克隆胚胎罪和非法采集人类遗传资源、走私人类遗传资源材料罪等罪名,但尚不足以应对可能出现的新基因技术利用行为的规制需求。由于基因技术利用行为具有强烈的风险不确定性以及强伦理性,对这类行为的规制应当以风险预防原则为基础展开。在现有刑法框架下,对相关行为可以通过对现有罪名,如以危险方法危害公共安全罪、故意伤害罪等罪名的解释适用进行规制,但这样仅能起到事后惩罚作用,而无法实现风险的提前预防。所以最有效方式是通过立法途径对风险进行溯源预防,即在基因开发利用行为的研究阶段就采取较为严格的规制措施,必要时设立新的罪名。     

2006～2008年重庆部分区县PRRSV分离株ORF5和Nsp2基因的遗传变异分析

为了解重庆市PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2006～2008年分离到的14株重庆市内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和0RF5基因序列的测定和分析.结果显示,与2006年以来国内流行的变异毒株相比,Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到97.3%～99.5%和98.2%～99.7%,这2个基因推导的氨基酸序列同源性分别达到95.7%～99.2%和98.0%～99.5%.与传统毒株相比,Nsp2和ORF5基因及其推导的氨基酸都存在点突变,并在Nsp2基因内部存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失,ORF5基因未存在缺失.从遗传进化以及变异情况看,重庆市流行的PRRSV主要为变异毒株,属于美洲型中的亚群Ⅱ.     

猪胸膜肺炎放线杆菌半套式PCR检测方法的建立及应用

根据1型胸膜肺炎放线杆菌apx Ⅳ A基因3'端序列设计3条引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的半套式PCR方法.筛选了该方法的最佳反应条件,并采用该方法进行临诊检测,比较了不同处理临床样品的检测结果.结果表明,该方法能检测出所有供试血清型APP,不能从猪上呼吸道常见细菌基因组DNA中扩增出条带,特异性好;最低DNA检出量为16.5 fg,其灵敏性是常规PCR方法的1 000倍;重复性试验结果表明,该方法稳定可靠.应用半套式PCR方法检测临床样品,检出率显著高于细菌分离鉴定;样品保存方法和核酸抽提方法能影响阳性样品的检出率.     

猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定及其E基因分析

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测猪流产胎儿病料中的乙型脑炎病毒(JEV),并对阳性病料做病毒分离与纯化.通过空斑减数试验测定了分离株和JEV P3株的中和指数.对分离株的prM-E基因进行克隆并测序,将推导的E蛋白序列与GenBank中登录的JEV毒株的E蛋白序列做比较分析.以E基因序列为基础,绘制进化树.结果显示,在检测的9份病料中有3份呈JEV阳性,并分离出1株JEV,命名为HEN0701.经测定,P3株的中和指数为12,分离株的中和指数为2.prM与E基因的序列分析表明,分离株与P3和Beijing-1株的同源性较低,最高仅为87.7%;而与JEV/sw/Mie/40/2004、KV1899、SH17M-07和YN79-Bao83株的同源性较高,最低为96.6%.进化分析表明,分离株属基因Ⅰ型.E蛋白序列分析结果显示,分离株与基因Ⅰ型JEV的E蛋白序列高度同源,且与SH-53、JEV/sw/Mie/40/2004和VN22/Viet Nam/2002/swine blood株的E蛋白序列完全相同,而与基因Ⅲ型JEV的E蛋白序列存在4个共同的氨基酸变异位点.     

猪肺炎霉形体p52基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经Pine Ⅰ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-293细胞,包装成完整的腺病毒,经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定后扩增,收集病毒液,免疫BALB/c小鼠,并分析了体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫效果.结果表明,重组质粒pShuttle-CMV-P52插入片段为1 202 bp;同源重组成功;重组腺病毒可以正确表达目的蛋白,效价达1×106TCID50/mL.重组病毒经肌肉注射和滴鼻均可诱导小鼠产生血清和肺匀浆液特异性IgG、SIgA,但不能诱导特异的淋巴细胞增殖.证实,成功构建了表达p52基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的体液免疫和黏膜免疫,但不产生细胞免疫应答.     

组成新发典型甲型H1N1流感病毒8个基因片段的变异性分析与疫病流行原因初探

为探索新近暴发的甲型H1N1流感病毒各基因片段的变异性与本次疫病流行的内在原因,以NCBI GenBank中报道的l株新发的典型H1N1甲型流感病毒A/New York/1669/2009(H1N1)作为研究对象,运用在线BLAST和CLUSTAL X等生物信息学软件对其PA、NP、M、PB1、PB2、NA、HA和NS基因片段进行了比较分析.结果表明,新发甲型H1N1流感毒株的PB1、NP基因来源于人源谱系流感病毒,HA、NA、NS、M基因来源于猪源谱系流感病毒,PB2和PA基因来源于禽源谱系流感病毒.此外,新发甲型H1N1流感病毒的HA和NA分别在第249和386位新出现1个"-NTT-"、"-NFSI-"的糖基化位点.HA的6个潜在抗原决定簇中有3个发生了氨基酸序列改变,NA则是12个中有5个发生了改变.表明,这些抗原基因的大范围重组与高频率变异可能是造成这次流感暴发与大规模流行的根本原因.     

猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3'端对病毒样颗粒形成的影响

以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3'端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析.结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒.通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3'端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3'端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒.     

传染性支气管炎病毒S-ChIL-15融合基因真核表达质粒的构建及其体外表达

通过一段编码(G3S)4多肽的碱基linker将传染性支气管炎病毒(IBV)S基因和鸡IL-15(ChlL15)基因连接,构建了pcDNA3.1-IBVS-ChIL-15融合基因重组质粒.将该重组质粒转染Vero细胞,并通过RT-PCR、免疫组织化学及免疫荧光试验对重组质粒的体外瞬时表达情况进行检测.结果显示,成功构建了S-ChIL-15融合基因,转染24 h后能检测到IBVS-ChlL-15融合基因和该融合基因瞬时表达的产物.     

旋毛虫p46000抗原基因的转录及表达特性鉴定

根据旋毛虫p46000抗原基因和葡萄糖3一磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列设计特异引物,以不同发育时期旋毛虫总RNA为模板进行SYBR Green染料法实时定量RT-PCR检测p46000基因转录情况.制作不同发育时期旋毛虫虫体及感染组织石蜡切片,采用免疫荧光染色技术检测p46000抗原的表达及定位情况.结果显示,p46000抗原基因在旋毛虫不同发育时期均有转录,但转录水平有明显差异,转录高峰集中于成虫和肌幼虫期,新生幼虫期明显低于其他时期.天然p46000抗原蛋白定位于杆状体和虫体表面,表达高峰集中于成虫、肠道期及成囊期肌幼虫.表明,p46000抗原基因的转录与表达具有一定的时空特异性.该基因在旋毛虫的寄生过程中尤其在早期感染中具有重要作用且可能与旋毛虫的免疫逃避有关.     

猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株VP1蛋白的原核表达及其反应原性

根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株的基因组序列(GenBank登录号:DQ355222)设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出了PTV的VP1基因片段,将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,构建了重组质粒pET-VP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达.结果表明,重组菌可表达分子质量为45 ku的融合蛋白,在1.0 mmol/L IPTG诱导6 h后,重组菌的表达效果最好,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的63.4%,表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中.表达产物经Ni柱纯化后,薄层扫描显示,目的蛋白的纯度达到了97%.Western-blot结果显示,纯化后的VP1蛋白能与PTV Swine/CH/IMH/03株阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,表明,原核表达的VP1蛋白具有良好的反应原性.