猪ARAF基因真核表达及其对PK15细胞凋亡的调控作用

为研究猪ARAF(v-raf murine sarcoma 3611 viral oncogene homo)lo基g因在PK15细胞的表达、定位及其对细胞凋亡的调控作用,本文以PK15细胞为研究对象,RT-PCR扩增猪ARAF基因CDS序列,经TA克隆至载体pGEM-T-Easy,随后加酶切位点和保护性碱基设计引物,PCR扩增后,构建重组真核表达载体pc DNA3.1-EGFP-ARAF,重组载体经脂质体法转染PK15细胞,荧光显微镜观察转染效果,qPCR与Westernblot分别检测A R A F基因mRNA和蛋白表达水平,间接免疫荧光试验观察猪A R A F的亚细胞定位;同时,流式细胞术及免疫印迹试验探究ARAF对PK15细胞凋亡的影响。结果显示,构建的重组真核表达载体转染成功,荧光显微镜检查可见转染组和空载组细胞均表达绿色荧光蛋白。转染组细胞ARAF基因mRNA及蛋白表达量较空载组和空白对照组显著升高（P<0.01）。激光共聚焦显微镜观察到该基因表达蛋白主要定位于PK15细胞胞质中。流式细胞术及免疫印迹试验检测时可见转染组PK15细胞凋亡率显著增加;相较空载组和空白对照...     

猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

针对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的N基因建立检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示,本方法特异性高,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪肠病毒、伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪星状病毒等病原无交叉反应。本方法C_t值与标准模板浓度在10^8.5～10^3.5PFU/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R²)为0.994 9,直线方程为y=-3.594 9x+41.006,最低检测限为10^2.50PFU/mL。运用该方法检测PDCoV感染不同来源细胞系的病毒载量,发现的PDCoV感染宿主谱广,能感染不同来源的细胞,且在LLC-PK细胞上的复制能力最强。本研究建立的方法为PDCoV的防控提供了技术支持。     

抑制Caspase-1活化能减弱玉米赤霉烯酮诱导的猪小肠上皮细胞凋亡

为探究玉米赤霉烯酮（ZEA）对猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）毒性机制中细胞焦亡与凋亡间的关系,用不同质量浓度的ZEA(0、5、10、15μg/m L)处理细胞24 h以及ZEA(15μg/m L)与乙酰半胱氨酸（NAC,1 mmol/L）或Z-YVAD-FMK(10μmol/L)联合作用24 h。采用CCK-8法检测存活率;微板法测定细胞上清中乳酸脱氢酶（LDH）含量水平;免疫印迹检测剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Cleaved Caspase-1)蛋白水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和ELISA测定白细胞介素（IL）-18和IL-1β水平;流式细胞术检测活性氧（ROS）水平和细胞凋亡率;免疫荧光检测Caspase-3表达水平。结果显示,ZEA引起IPEC-J2细胞存活率降低和LDH含量升高,呈剂量依赖性（P<0.05,P<0.01）。与0μg/m L组比较,ZEA处理后细胞中剪切的Caspase-1、IL-18和IL-1β水平均明显升高（P<0.05,P<0.01）。NAC孵育显著降低了ZEA处理细胞的ROS水平、剪切的Caspase-1蛋白表达以...     

基于网络药理和细胞实验探索芪玉三龙方治疗非小细胞肺癌的机制

目的 采用网络药理学和细胞实验探究芪玉三龙方治疗非小细胞肺癌的潜在作用机制。方法 利用中药系统药理学数据库与分析平台和中医药整合数据库检索芪玉三龙方成分筛选靶点,通过美国肿瘤基因组图谱数据库获得肺癌靶点基因。构建蛋白相互作用网络,并采用基因本体数据库和京都基因和基因组百科全书数据库进行富集分析。对核心靶蛋白与化合物进行分子对接分析,并以A549细胞进行实验验证。结果 芪玉三龙方对于非小细胞肺癌的潜在有效靶点162个,蛋白相互作用网络分析得到核心靶点基因20个,主要的生物学过程为对缺氧的反应、MAPK级联、炎症反应,主要的功能通路为钙信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、细胞周期。分子对接结果表明,MMP9-槲皮素、PPARG-异鼠李素、PTGS2-刺芒柄花素、JUN-刺芒柄花素之间存在有效的结合亲和力。在A549细胞实验中,PCR和Western blot分析结果表明,芪玉三龙方含药血清能够促进PPAR-γ mRNA和蛋白表达（P＜0.05）,抑制c-JUN、COX-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达（P＜0.05）。结论 芪玉三龙方通过影响A549肺癌细胞的凋亡、侵袭和肿瘤血管生成及炎症进程达到干预肺癌的作用。     

经椎间孔椎体间融合术联合独活寄生汤加减治疗单间隙腰椎管狭窄症20例

目的 观察经椎间孔椎体间融合术联合独活寄生汤治疗单间隙腰椎管狭窄症的临床疗效。方法 将40例单间隙腰椎管狭窄症患者分为观察组和对照组,每组20例,两组均行经椎间孔椎体间融合术,仅观察组术后服用独活寄生汤,对比观测两组术后椎体高度、手术前后腰痛视觉模拟量表（visual analogue scale,VAS）评分和Oswestry生活功能障碍指数（Oswestry disability index,ODI）评分的差异。结果 各时点两组椎体前缘、中缘、后缘高度比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。与术前比较,两组术后1个月椎体前缘、中缘、后缘高度均显著上升（P<0.05）;与术后1个月比较,术后3、6、12个月两组椎体前缘、中缘、后缘高度均逐渐降低。与术前比较,两组患者术后1、3、6、12个月腰痛程度VAS评分和ODI评分均逐渐降低（P<0.05）。与对照组比较,术后3、6个月观察组患者腰痛程度VAS评分均显著降低（P<0.05）;术后1、3、6、12个月观察组患者ODI评分均显著低于对照组（P<0.05）。结论 经椎间孔椎体间融合术联合独活寄生汤治疗单间隙腰椎管狭窄症,能显著缓解患者疼痛,改善腰椎功能。     

痴呆健脑方调控NEK7/NLRP3炎症小体通路防治血管性痴呆

目的 探讨痴呆健脑方调控NEK7/NLRP3炎症小体通路防治血管性痴呆的作用机制。方法 按照改良双侧颈总动脉分次结扎法复制血管性痴呆大鼠模型。将100只SD大鼠随机分为假手术组,模型组,多奈哌齐组,痴呆健脑方高、中剂量组;采用Morris水迷宫法评价大鼠记忆功能,苏木精—伊红染色观察大鼠海马组织形态学变化,TUNEL法检测大鼠海马区神经元凋亡率,透射电子显微镜观察大鼠海马组织超微结构,分别采用Real-time PCR法和Western blot法检测大鼠海马NIMA相关激酶7(NIMA-related kinase 7,NEK7)、Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3 (Nod-like receptor family, pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)、含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶 (cysteinyl aspartate specific proteinase 1, Caspase-1)、消皮素D (gasdermin D,GSDMD)mRNA和蛋白表达水平,ELISA法检测各组大鼠海马区白细胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-6、IL-18、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平。结果 与模型组比较,多奈哌齐组,痴呆健脑方高、中剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05）,穿越平台次数明显增加（P<0.05）,目标象限时间比明显升高（P<0.05）。与模型组比较,多奈哌齐组,痴呆健脑方高、中剂量组大鼠海马区虽有部分核染色凋亡神经元,但神经元凋亡率明显低于模型组。与模型组超微结构不同,多奈哌齐组,痴呆健脑方高、中剂量组神经元整体形态规则,神经元间隙均匀致密,神经元结构层次分明、结构相似,核固缩、碎裂及坏死神经元极少。与模型组比较,多奈哌齐组,痴呆健脑方高、中剂量组海马区NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA和蛋白表达水平以及IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平均明显降低（P＜0.05）。结论 痴呆健脑方通过抑制NEK7/NLRP3炎症小体通路相关蛋白水平,降低神经元凋亡后下游炎症因子表达水平,达到改善血管性痴呆大鼠认知、记忆功能的目的。     

诚信:作为整合社会的隐性张力

以诚信在道德认知上被普遍认同但为何在实践上却发生危机的问题开始,进而界定了诚信问题的三大发生领域“个人潜状态诚信领域”、“熟人之间诚信领域”、“陌生公民间诚信领域”,并进一步分别对在此三领域中诚信如何作为一种隐性张力而发生作用的相关因素进行批判性剖析,并澄清诚信危机以及承待解决的关键领域是“陌生公民间诚信领域”诚信问题,最后基于以上分析对解决转型社会时期关键的诚信问题提出理论上的反思与筹划,从而试图从一个全新角度作出使诚信恢复整合社会的隐性张力的有效对策。     

25句话速览《决定》

1坚持依法治国首先要坚持依宪治国 坚持依法治国首先要坚持依宪治国,坚持依法执政首先要坚持依宪执政。 2我国拟建立宪法宣誓制度 将每年十二月四日定位国家宪法日。建立宪法宣誓制度,凡经人大及其常委会选举或者决定任命的国家工作人员正式就职时公开向宪法宣誓。     

描绘欧洲未来的蓝图--欧洲一体化进程中的宪法条约解析

《欧盟宪法条约》经过近一年的谈判终于在布鲁塞尔政府间会议上获得通过。这标志着欧洲联盟宪法化揭开了新的篇章。本文从欧洲一体化演进中的宪法化进展、《欧盟宪法条约》的现实意义及欧洲联盟宪法化的最终指向三个方面,对欧盟一体化进程的发展动向进行分析,对学界的一些观点进行探讨。《欧盟宪法条约》是欧洲一体化棋局中的关键步骤,既包含了对理想的追求也反映了对现实的妥协,欧洲宪政在宪法主义和政府间主义的张力下小心翼翼地保持着平衡。     

抗原表位预测方法的研究进展

概述了B细胞线性表位、B细胞构象性表位、CTL表位及Th表位等抗原表位预测方法的研究进展,并对每种表位预测方法的预测结果进行了比较,旨在为从事抗原表位研究的人员提供理论参考.